【正文】 核內。3）散在重復順序。第二代遺傳標記是STR（short tandem repeat，簡短串連重復序列 ），6000個標記。細胞凋亡是維持個體生存所必需的一種生物學機制。(2).多樣性：環(huán)境因素不同，細胞類型不同，或刺激因素不同時，從凋亡程序啟動到凋亡發(fā)生，其信號傳遞途徑是不同的。異常情況下：當細胞DNA損傷、紡錘體絲斷裂、癌基因異常表達等細胞生存面臨威脅時； P53水平迅速升高和活化；2）P53對細胞凋亡和細胞周期的調節(jié)作用：野生型P53蛋白具維持細胞生長、抑制惡性增殖的作用； P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負責維持基因組的完整性、DNA損傷修復和細胞周期的正常運轉；如果損傷不能修復， P53就激活那些誘導凋亡的基因表達，使細胞進入凋亡狀態(tài)。2）促進凋亡：bax，bclxs ，bad。發(fā)病的分子機制：1）淋巴細胞中調節(jié)細胞凋亡的一個關鍵分子是細胞表面受體Fas（又稱APO或CD95）， Fas受體與FasL （配體）結合即可激活凋亡信號傳導途徑，細胞凋亡；2） T細胞表面受體Fas和FasL發(fā)生突變時，T細胞不能發(fā)生正常凋亡，導致自身免疫性疾病。1）大多數(shù)腫瘤P53突變、而有些腫瘤過度表達Bcl2蛋白，這些可有效地以避免細胞凋亡發(fā)生。4）周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI） ：1）細胞周期的啟動（G0→G1）；2)DNA復制（ G0→S ）；3）進入M期 (G2M)； 1）細胞周期的啟動：細胞在生長因子的刺激下，Cyclin D表達，與CDKCDK6結合而活化激酶224。大多數(shù)蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法。 注意事項：在加入試劑30 min后呈色達到飽和，時間延長顏色信號減弱；許多干擾物質降低顏色反應；高鹽濃度可引起沉淀。(3). 離心除去膜組分等獲得可溶性蛋白質。分離包涵體224。由于這三種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高。注意: 超聲波產生的化學自由基團能使敏感的活性物質變性失活，另外噪聲也比較大。 2）根據分子量的不同分離：.； ； 。19 .聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)：聚丙烯酰胺凝膠的性能：1）機械強度好，有彈性透明，相對地化學穩(wěn)定，對pH和溫度變化較穩(wěn)定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的；2）沒有吸附和電滲作用. 通過改變濃度和交聯(lián)度，可以控制孔徑變化在極廣泛的范圍，并且制備凝膠的重復性好；3）由于純度高及不溶性，還適合于少量樣品的制備， 不致污染樣品。7）條帶擴散：電壓過低，電泳時間過長；緩沖液離子強度太低；樣品本身結構不均一。與調控目的基因有關的兩個蛋白質X蛋白與Y蛋白,將X蛋白的編碼基因與BD結構域基因融合(表達所得的融合蛋白為”誘餌”蛋白), ,Y蛋白的編碼基因與AD結構域基因融合(表達所得的融合蛋白稱為”獵物”蛋白)。：(1)．高敏感性；(2)．真實性；(3) 簡潔性；（4）廣泛性。采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構建cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質，適用于部分細胞質、細胞核及膜結合蛋白。：1）假陽性較多；2）轉化效率偏低；3）陰性干擾。②采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調控區(qū)各不相同。：(1)某些誘餌蛋白具有自身激活性質。陽性克隆必須進行體外翻譯和表達，用抗原表位特異性的抗體進行共定位研究. 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結果一定要通過其它的實驗手段來驗證。 應用：研究DNA蛋白質相互作用。 應用：1）用于篩選缺陷等位基因的研究：在穩(wěn)定、全長及能夠形成正確蛋白質折疊的條件下，已有了幾種遺傳學策略來篩選作用缺陷性等位基因；2）在反式作用解離分子方面的應用；3）在蛋白質組研究方面的應用：利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進行預清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。(3)有多個利于選擇和篩選的遺傳表型或標志，包括抗藥性、營養(yǎng)缺陷型、噬菌斑形成及顯色反應。② l噬菌體的成熟需要包裝，當與外源DNA重組后的大小介于原來的75%～105%之間時，重組的DNA分子才可包裝為成熟的噬菌體顆粒。②修復雙鏈DNA分子中單鏈缺口。3）分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術。4）同聚物接尾法：適用于在質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。 核酸分子雜交應用：1）基因克隆的篩選；2）酶切圖譜的制作；3）基因組中特定基因序列的定量和定性分析；4）基因突變分析；5）疾病的診斷。(7).價格低廉。(3)RNA探針的標記。:Dig+dUTP→ DigdUTP DigdUTP標記DNA方法: 切口平移法與隨機引物標記法檢測方法: DigDNA探針+抗Dig抗體ALP或HRP+底物（BCIP+NBT）。端是人工合成的引物，是特定的，3 39。端；4）引物自身不應有連續(xù)超過3個bp的互補序列；5）引物的3 39。模板DNA的拷貝數(shù)；3。：1）研究目的: 研究啟動子和調控元件所選的報告基因載體的組成不同，前者的載體不含啟動子，后者則相反。但只有二者共轉染昆蟲細胞，才能得到重組的桿狀病毒和在細胞中表達外源蛋白質。重要包括：CAAT盒和GC盒。：一個真核生物基因的轉錄需要3至5個轉錄因子。3）增強子與調基因可以很遠，上游啟動子亦相隔數(shù)十個堿基。(4)外源基因下游應加入不依賴于ρ因子的轉錄終止區(qū):(1).原核細胞的RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，故需使用原核啟動子。(4). 表達細胞(宿主)的選擇: 依據promoter與 host的相容性來選擇。：1）穩(wěn)定的遺傳和復制能力。：1）非融合表達載體：細胞因子的表達； 2）融合表達載體：分子量較小蛋白質表達；3）帶純化標簽表達載體：便于目的蛋白純化的標簽；4）分泌型表達載體；5）表面展示表達載體；6）帶分子伴侶的表達載體。4）工程化宿主菌的選擇九、差異表達基因 ：篩選與疾病發(fā)生相關的功能基因：可深入研究基因組所有基因的功能研究意義：從基因水平揭示疾病的發(fā)生機制，探索治療疾病的有效方法。(subtractive hybridization,SH )： 將實驗組mRNA(或cDNA)與對照組cDNA(或mRNA）雜交，去除雜交體和未雜交上的對照組成分（cDNA或mRNA），得到的為實驗組獨有的mRNA或cDNA，這些基因即是差異表達基因。2）雜交方式：固液相雜交。在檢測細胞的潛在感染方面也具有重要意義。：PCRASOH探針雜交法： 根據突變位點的上下游序列，設計合成寡核苷酸引物。是由于α 珠蛋白基因的缺失或缺陷使α 鏈的合成受到抑制而引起的溶血性貧血。輕型a地貧患者之間婚配，生育子女中患 Hb Bart’s胎兒水腫綜合征的機率為1/4。目的基因導入靶細胞224。3）原位法 ( in situ )直接向患者的病變部位轉基因。：1）基因置換(基因矯正)：有兩種含義:其一,指將致病基因整個地以正常基因置換，使致病基因永久性得到更正；其二，指對缺陷基因的異常序列進行精確的原位修復但不影響鄰近的基因。2）同一分子上包括有催化部份和底物部份。 1~2月治療一次, %。(2)待測樣品核酸的提取、擴增與標記：探針不標記，而待測核酸(液相)標記。重復上述步驟，直至合成完所需探針. (二)壓電打印法. (三)分子印章法: 寡核苷酸合成試劑224。 靶分子；探針224。過柱(濾去游離的熒光核苷酸)224。與靶細胞的受體特異性結合224。（PTK or TPK）：1）此類激酶促進蛋白質中酪氨酸的磷酸化。：1）分子量2萬3萬的單鏈結構，功能類似異三聚體G protein的α亞基，可結合GTP或GDP,并有GTP酶活性；2）最重要的是癌基因Ras和 Rho亞家族；3）RasGTP代表“開”,RasGDP代表“關”.控制信號轉導。2）胞內受體：位于細胞漿和細胞核中的受體，全部為DNA結合蛋白。酶224。② 調節(jié)基因表達。：1) TNF――――― Cer 等激酶系統(tǒng)――――――激活NF kB病毒感染、脂多糖、活性氧中間體、佛波酯、雙鏈RNA等 2)生理意義：主要涉及機體防御反應、組織損傷和應激、細胞分化和凋亡，以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞。利尿和舒張血管的作用。生物學效應. 3）生理意義：通過對效應蛋白的磷酸化作用，實現(xiàn)其調節(jié)功能，如促進蛋白質合成、改變膜對水及離子通道的通透性、影響細胞分泌、加強心肌收縮。 蛋白激酶Ａ途徑：1）組成: 胞外信息分子，受體，G蛋白，腺苷酸環(huán)化酶AC)， cAMP，蛋白激酶 A(PKA)。 PI4P———PI（4）P2。：1）G蛋白是多種膜受體傳入信號的“開關”。：1）由兩個相同亞基組成；2）被cGMP激活；信號通路：3）ANP,NO,細菌內毒素等→作用于具有GC活性的受體→GC激活→cGMP↑→PKG活性↑→蛋白磷酸化→生理效應：1）與病毒癌基因 vakt編碼的蛋白Akt同源，又稱為Akt；2）為單鏈結構，有三種亞型；3）可與PIP3結合而間接被激活；4）與細胞代謝、凋亡、癌變有關。：1）疾病診斷所依據的標志性蛋白質分子；2）對藥物的療效、毒副作用作出評價；3）尋找藥物作用的靶蛋白。：注意事項：1）不同來源的樣品分別用不同顏色的熒光素標記(Cy3為紅色,標記處理組；Cy5為綠色,標記對照組)，以便比較分析；） 2）對同一種dNTP，既要加入熒光標記的，也要加入非標記的(如Cy3dCTP與dCTP)，并調整兩者的比例，使雜交信號最強。2）芯片雜交的特點：探針的數(shù)量靶基因的數(shù)量。用激光點光源照射聚合部位,以去除光敏保護基(X),露活性羥基(OH)224。十一、生物芯片 ：1）易尋址，利用組合化學的原理安排各寡核苷酸的位點，芯片反應后易尋址；2）點位牢固，用表面化學方法處理基片，使核苷酸固定在基片上；3）定點合成，光導向平板印刷技術，芯片表面可用屏蔽物屏蔽，光照選擇性脫保護，有利于定點合成寡核苷酸中的各個堿基；目前技術可達的集成度：10萬40萬點陣/cm2，探針長度8nt20nt。重組分子224。 基因干預的靶基因：過度表達的癌基因、病毒復制周期的關鍵基因。具有二倍體基因，RV可將其基因組整合到感染細胞的DNA上。 2） 間接法(回輸法) ( ex vivo )或稱離體法。 2）PCR方法：設計3條引物進行雙重PCR擴增，A）若擴增出AB的314bp片段，而不能擴增出AC片段，則為正常；B）若擴增出AB的314bp片段,且能擴增出一條500600bp的片段(縮短了的AC),則為a地1；C）若只能擴增一條500600bp的片段，但不能擴增出AB的314bp片段,則為Bart’s水腫胎。（B）.血紅蛋白H病：基因型 : a / 或 a / 亦可為 a aT/ ，稱為a0地貧和a+地貧的雙重雜合子。：1）PCRRFLP分析；2）PCR限制酶酶譜分析；3）ASPCR；4）PCRSSCP；5）DNA測序等。3）優(yōu)點：方法簡便,靈敏度較高。(ISPCR )技術：1）,在不破壞細胞的前提下,利用一些特定的檢測手段(例如，分子雜交)來檢測細胞內的擴增產物。 2）基本原理：第一步 用限制性內切酶（Rsa I或Hea III）對雙鏈cDNA消化；第二步把Tester cDNA均分為兩份,分別連接接頭；第三步兩輪消減雜交；第四步加入引物作2次PCR擴增。：雜交和洗滌條件難把握，會導致一定的假陽性率或假陰性率，分析圖象和數(shù)據耗時。B）.利用某些蛋白水解酶基因的缺陷株為宿主菌。5）具備外源基因插入的酶切位點。 缺點：缺少真核生物的蛋白質翻譯后修飾和加工系統(tǒng)。(5).外源基因在原核細胞的高效表達產物多為包含體。： 選擇剪接方式：1）外顯子選擇：也稱外顯跳躍，選擇不同的外顯子進行剪接，成熟mRNA中外顯子數(shù)目不同；2）內含子選擇：在不同的成熟mRNA中，內含子可全無或保留某一個；3）相斥外顯子：二個外顯在不同成熟mRNA中只能出現(xiàn)其一，而不能共存；4）內部剪接點：剪接點異常，導致成熟mRNA出現(xiàn)的只是某個外顯子或內含子的一部分。1）反式作用因子的活性調節(jié)：表達式調節(jié): 需要時才合成, 隨即被降解。4）反應元件：某些反式作用因子與特定刺激信號結合后，能與某些上游啟動子元件和增強子所結合，調節(jié)基因表達，這類順式作用元件即特稱中反應元件5）沉默子：能抑制啟動子活性的DNA序列。B：采用線性化的、必需病毒序列缺陷的野生型桿狀病毒（此病毒DNA不具備感染能力）共轉染。：（一）穩(wěn)定表達的細胞：：L細胞、Ltk細胞、NIH 3T3細胞、Sp2/0和NSO細胞、CHO細胞等；：HEK29HeLa、HL60、HT1080等細胞； ㈡瞬時表達的細胞：COS細胞和HEK 293細胞； ㈢哺乳動物細胞的選擇：細胞選擇的依據主要決定于基因表達的目的。八、外源基因的表達：酵母、昆蟲（果蠅與非果蠅類）、哺乳動物。端可進行修飾；7）引物與非擴增序列同源性應70%或連續(xù)8個互補；8）擴增編碼區(qū)中,引物3 39。引物的常用濃度范圍：～1μmol/L，在100μl中引物的量為25～100 pmol, 假如用25μmol/L濃度的引物貯備液只需加1～ 4μl。：(1)．DNA模板變性 (denature)：95℃左右高溫使模板DNA完全變性。，隨機引物標記法，DNA的3′末端標記等均為延長核苷酸的反應，而且要讓32P進入鏈中，故應選擇[α32P]dNTP， 50μci/反應，無特殊原因首選[α32P]dCTP。 缺點：1）靈敏度不太高；2）特異性不太高。(3).具有較高的化學穩(wěn)定性，能耐較高溫度和保存時間。 不同點：(變性方法) Northern印跡雜交：聚乙二醛、二甲亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞。：1）限制性內切酶酶切位點添加法； 2）T/A克隆法：1）粘性末端連接法：適用于插入片段和載體具有相同的粘性末端。：催化DNA，RNA以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的 5′ 磷酸基團水解。 ③酚/氯仿抽提，乙醇沉淀； 酶切鑒定 ：瓊脂糖凝膠電泳：大腸桿菌DNA聚合酶I大片段，缺5′→ 3′外切酶活性。 （三）按載體來源分類：質粒載體，噬菌體載體，病毒載體，酵母人工染色體，粘性載體。 種類：兩個融合蛋白的相互作用必須借助于第三種分子，而這第三種分子可以是蛋白質、小分子多肽