【正文】 核內(nèi)。3）散在重復(fù)順序。第二代遺傳標(biāo)記是STR（short tandem repeat，簡短串連重復(fù)序列 ），6000個(gè)標(biāo)記。細(xì)胞凋亡是維持個(gè)體生存所必需的一種生物學(xué)機(jī)制。(2).多樣性：環(huán)境因素不同，細(xì)胞類型不同，或刺激因素不同時(shí)，從凋亡程序啟動(dòng)到凋亡發(fā)生，其信號傳遞途徑是不同的。異常情況下：當(dāng)細(xì)胞DNA損傷、紡錘體絲斷裂、癌基因異常表達(dá)等細(xì)胞生存面臨威脅時(shí)； P53水平迅速升高和活化；2）P53對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用：野生型P53蛋白具維持細(xì)胞生長、抑制惡性增殖的作用； P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負(fù)責(zé)維持基因組的完整性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)；如果損傷不能修復(fù)， P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡的基因表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。2）促進(jìn)凋亡：bax，bclxs ，bad。發(fā)病的分子機(jī)制：1）淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵分子是細(xì)胞表面受體Fas（又稱APO或CD95）， Fas受體與FasL （配體）結(jié)合即可激活凋亡信號傳導(dǎo)途徑，細(xì)胞凋亡；2） T細(xì)胞表面受體Fas和FasL發(fā)生突變時(shí)，T細(xì)胞不能發(fā)生正常凋亡，導(dǎo)致自身免疫性疾病。1）大多數(shù)腫瘤P53突變、而有些腫瘤過度表達(dá)Bcl2蛋白，這些可有效地以避免細(xì)胞凋亡發(fā)生。4）周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI） ：1）細(xì)胞周期的啟動(dòng)（G0→G1）；2)DNA復(fù)制（ G0→S ）；3）進(jìn)入M期 (G2M)； 1）細(xì)胞周期的啟動(dòng)：細(xì)胞在生長因子的刺激下，Cyclin D表達(dá)，與CDKCDK6結(jié)合而活化激酶224。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。 注意事項(xiàng)：在加入試劑30 min后呈色達(dá)到飽和，時(shí)間延長顏色信號減弱；許多干擾物質(zhì)降低顏色反應(yīng)；高鹽濃度可引起沉淀。(3). 離心除去膜組分等獲得可溶性蛋白質(zhì)。分離包涵體224。由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。注意: 超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使敏感的活性物質(zhì)變性失活，另外噪聲也比較大。 2）根據(jù)分子量的不同分離：.； ； 。19 .聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)：聚丙烯酰胺凝膠的性能：1）機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性透明，相對地化學(xué)穩(wěn)定，對pH和溫度變化較穩(wěn)定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的；2）沒有吸附和電滲作用. 通過改變濃度和交聯(lián)度，可以控制孔徑變化在極廣泛的范圍，并且制備凝膠的重復(fù)性好；3）由于純度高及不溶性，還適合于少量樣品的制備， 不致污染樣品。7）條帶擴(kuò)散：電壓過低，電泳時(shí)間過長；緩沖液離子強(qiáng)度太低；樣品本身結(jié)構(gòu)不均一。與調(diào)控目的基因有關(guān)的兩個(gè)蛋白質(zhì)X蛋白與Y蛋白,將X蛋白的編碼基因與BD結(jié)構(gòu)域基因融合(表達(dá)所得的融合蛋白為”誘餌”蛋白), ,Y蛋白的編碼基因與AD結(jié)構(gòu)域基因融合(表達(dá)所得的融合蛋白稱為”獵物”蛋白)。：(1)．高敏感性；(2)．真實(shí)性；(3) 簡潔性；（4）廣泛性。采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時(shí)期的材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白。：1）假陽性較多；2）轉(zhuǎn)化效率偏低；3）陰性干擾。②采用多個(gè)報(bào)告基因，且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。：(1)某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。陽性克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究. 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實(shí)驗(yàn)手段來驗(yàn)證。 應(yīng)用：研究DNA蛋白質(zhì)相互作用。 應(yīng)用：1）用于篩選缺陷等位基因的研究：在穩(wěn)定、全長及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾種遺傳學(xué)策略來篩選作用缺陷性等位基因；2）在反式作用解離分子方面的應(yīng)用；3）在蛋白質(zhì)組研究方面的應(yīng)用：利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進(jìn)行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。(3)有多個(gè)利于選擇和篩選的遺傳表型或標(biāo)志，包括抗藥性、營養(yǎng)缺陷型、噬菌斑形成及顯色反應(yīng)。② l噬菌體的成熟需要包裝，當(dāng)與外源DNA重組后的大小介于原來的75%～105%之間時(shí)，重組的DNA分子才可包裝為成熟的噬菌體顆粒。②修復(fù)雙鏈DNA分子中單鏈缺口。3）分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù)。4）同聚物接尾法：適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)。 核酸分子雜交應(yīng)用：1）基因克隆的篩選；2）酶切圖譜的制作；3）基因組中特定基因序列的定量和定性分析；4）基因突變分析；5）疾病的診斷。(7).價(jià)格低廉。(3)RNA探針的標(biāo)記。:Dig+dUTP→ DigdUTP DigdUTP標(biāo)記DNA方法: 切口平移法與隨機(jī)引物標(biāo)記法檢測方法: DigDNA探針+抗Dig抗體ALP或HRP+底物（BCIP+NBT）。端是人工合成的引物，是特定的，3 39。端；4）引物自身不應(yīng)有連續(xù)超過3個(gè)bp的互補(bǔ)序列；5）引物的3 39。模板DNA的拷貝數(shù)；3。：1）研究目的: 研究啟動(dòng)子和調(diào)控元件所選的報(bào)告基因載體的組成不同，前者的載體不含啟動(dòng)子，后者則相反。但只有二者共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，才能得到重組的桿狀病毒和在細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白質(zhì)。重要包括：CAAT盒和GC盒。：一個(gè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。3）增強(qiáng)子與調(diào)基因可以很遠(yuǎn)，上游啟動(dòng)子亦相隔數(shù)十個(gè)堿基。(4)外源基因下游應(yīng)加入不依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū):(1).原核細(xì)胞的RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動(dòng)子，故需使用原核啟動(dòng)子。(4). 表達(dá)細(xì)胞(宿主)的選擇: 依據(jù)promoter與 host的相容性來選擇。：1）穩(wěn)定的遺傳和復(fù)制能力。：1）非融合表達(dá)載體：細(xì)胞因子的表達(dá)； 2）融合表達(dá)載體：分子量較小蛋白質(zhì)表達(dá)；3）帶純化標(biāo)簽表達(dá)載體：便于目的蛋白純化的標(biāo)簽；4）分泌型表達(dá)載體；5）表面展示表達(dá)載體；6）帶分子伴侶的表達(dá)載體。4）工程化宿主菌的選擇九、差異表達(dá)基因 ：篩選與疾病發(fā)生相關(guān)的功能基因：可深入研究基因組所有基因的功能研究意義：從基因水平揭示疾病的發(fā)生機(jī)制，探索治療疾病的有效方法。(subtractive hybridization,SH )： 將實(shí)驗(yàn)組mRNA(或cDNA)與對照組cDNA(或mRNA）雜交，去除雜交體和未雜交上的對照組成分（cDNA或mRNA），得到的為實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有的mRNA或cDNA，這些基因即是差異表達(dá)基因。2）雜交方式：固液相雜交。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。：PCRASOH探針雜交法： 根據(jù)突變位點(diǎn)的上下游序列，設(shè)計(jì)合成寡核苷酸引物。是由于α 珠蛋白基因的缺失或缺陷使α 鏈的合成受到抑制而引起的溶血性貧血。輕型a地貧患者之間婚配，生育子女中患 Hb Bart’s胎兒水腫綜合征的機(jī)率為1/4。目的基因?qū)氚屑?xì)胞224。3）原位法 ( in situ )直接向患者的病變部位轉(zhuǎn)基因。：1）基因置換(基因矯正)：有兩種含義:其一,指將致病基因整個(gè)地以正常基因置換，使致病基因永久性得到更正；其二，指對缺陷基因的異常序列進(jìn)行精確的原位修復(fù)但不影響鄰近的基因。2）同一分子上包括有催化部份和底物部份。 1~2月治療一次, %。(2)待測樣品核酸的提取、擴(kuò)增與標(biāo)記：探針不標(biāo)記，而待測核酸(液相)標(biāo)記。重復(fù)上述步驟，直至合成完所需探針. (二)壓電打印法. (三)分子印章法: 寡核苷酸合成試劑224。 靶分子；探針224。過柱(濾去游離的熒光核苷酸)224。與靶細(xì)胞的受體特異性結(jié)合224。（PTK or TPK）：1）此類激酶促進(jìn)蛋白質(zhì)中酪氨酸的磷酸化。：1）分子量2萬3萬的單鏈結(jié)構(gòu)，功能類似異三聚體G protein的α亞基，可結(jié)合GTP或GDP,并有GTP酶活性；2）最重要的是癌基因Ras和 Rho亞家族；3）RasGTP代表“開”,RasGDP代表“關(guān)”.控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。2）胞內(nèi)受體：位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的受體，全部為DNA結(jié)合蛋白。酶224。② 調(diào)節(jié)基因表達(dá)。：1) TNF――――― Cer 等激酶系統(tǒng)――――――激活NF kB病毒感染、脂多糖、活性氧中間體、佛波酯、雙鏈RNA等 2)生理意義：主要涉及機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細(xì)胞分化和凋亡，以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞。利尿和舒張血管的作用。生物學(xué)效應(yīng). 3）生理意義：通過對效應(yīng)蛋白的磷酸化作用，實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)功能，如促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、改變膜對水及離子通道的通透性、影響細(xì)胞分泌、加強(qiáng)心肌收縮。 蛋白激酶Ａ途徑：1）組成: 胞外信息分子，受體，G蛋白，腺苷酸環(huán)化酶AC)， cAMP，蛋白激酶 A(PKA)。 PI4P———PI（4）P2。：1）G蛋白是多種膜受體傳入信號的“開關(guān)”。：1）由兩個(gè)相同亞基組成；2）被cGMP激活；信號通路：3）ANP,NO,細(xì)菌內(nèi)毒素等→作用于具有GC活性的受體→GC激活→cGMP↑→PKG活性↑→蛋白磷酸化→生理效應(yīng)：1）與病毒癌基因 vakt編碼的蛋白Akt同源，又稱為Akt；2）為單鏈結(jié)構(gòu)，有三種亞型；3）可與PIP3結(jié)合而間接被激活；4）與細(xì)胞代謝、凋亡、癌變有關(guān)。：1）疾病診斷所依據(jù)的標(biāo)志性蛋白質(zhì)分子；2）對藥物的療效、毒副作用作出評價(jià)；3）尋找藥物作用的靶蛋白。：注意事項(xiàng)：1）不同來源的樣品分別用不同顏色的熒光素標(biāo)記(Cy3為紅色,標(biāo)記處理組；Cy5為綠色,標(biāo)記對照組)，以便比較分析；） 2）對同一種dNTP，既要加入熒光標(biāo)記的，也要加入非標(biāo)記的(如Cy3dCTP與dCTP)，并調(diào)整兩者的比例，使雜交信號最強(qiáng)。2）芯片雜交的特點(diǎn)：探針的數(shù)量靶基因的數(shù)量。用激光點(diǎn)光源照射聚合部位,以去除光敏保護(hù)基(X),露活性羥基(OH)224。十一、生物芯片 ：1）易尋址，利用組合化學(xué)的原理安排各寡核苷酸的位點(diǎn)，芯片反應(yīng)后易尋址；2）點(diǎn)位牢固，用表面化學(xué)方法處理基片，使核苷酸固定在基片上；3）定點(diǎn)合成，光導(dǎo)向平板印刷技術(shù)，芯片表面可用屏蔽物屏蔽，光照選擇性脫保護(hù)，有利于定點(diǎn)合成寡核苷酸中的各個(gè)堿基；目前技術(shù)可達(dá)的集成度：10萬40萬點(diǎn)陣/cm2，探針長度8nt20nt。重組分子224。 基因干預(yù)的靶基因：過度表達(dá)的癌基因、病毒復(fù)制周期的關(guān)鍵基因。具有二倍體基因，RV可將其基因組整合到感染細(xì)胞的DNA上。 2） 間接法(回輸法) ( ex vivo )或稱離體法。 2）PCR方法：設(shè)計(jì)3條引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，A）若擴(kuò)增出AB的314bp片段，而不能擴(kuò)增出AC片段，則為正常；B）若擴(kuò)增出AB的314bp片段,且能擴(kuò)增出一條500600bp的片段(縮短了的AC),則為a地1；C）若只能擴(kuò)增一條500600bp的片段，但不能擴(kuò)增出AB的314bp片段,則為Bart’s水腫胎。（B）.血紅蛋白H?。夯蛐?: a / 或 a / 亦可為 a aT/ ，稱為a0地貧和a+地貧的雙重雜合子。：1）PCRRFLP分析；2）PCR限制酶酶譜分析；3）ASPCR；4）PCRSSCP；5）DNA測序等。3）優(yōu)點(diǎn)：方法簡便,靈敏度較高。(ISPCR )技術(shù)：1）,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段(例如，分子雜交)來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 2）基本原理：第一步 用限制性內(nèi)切酶（Rsa I或Hea III）對雙鏈cDNA消化；第二步把Tester cDNA均分為兩份,分別連接接頭；第三步兩輪消減雜交；第四步加入引物作2次PCR擴(kuò)增。：雜交和洗滌條件難把握，會(huì)導(dǎo)致一定的假陽性率或假陰性率，分析圖象和數(shù)據(jù)耗時(shí)。B）.利用某些蛋白水解酶基因的缺陷株為宿主菌。5）具備外源基因插入的酶切位點(diǎn)。 缺點(diǎn)：缺少真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工系統(tǒng)。(5).外源基因在原核細(xì)胞的高效表達(dá)產(chǎn)物多為包含體。： 選擇剪接方式：1）外顯子選擇：也稱外顯跳躍，選擇不同的外顯子進(jìn)行剪接，成熟mRNA中外顯子數(shù)目不同；2）內(nèi)含子選擇：在不同的成熟mRNA中，內(nèi)含子可全無或保留某一個(gè)；3）相斥外顯子：二個(gè)外顯在不同成熟mRNA中只能出現(xiàn)其一，而不能共存；4）內(nèi)部剪接點(diǎn)：剪接點(diǎn)異常，導(dǎo)致成熟mRNA出現(xiàn)的只是某個(gè)外顯子或內(nèi)含子的一部分。1）反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表達(dá)式調(diào)節(jié): 需要時(shí)才合成, 隨即被降解。4）反應(yīng)元件：某些反式作用因子與特定刺激信號結(jié)合后，能與某些上游啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子所結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，這類順式作用元件即特稱中反應(yīng)元件5）沉默子：能抑制啟動(dòng)子活性的DNA序列。B：采用線性化的、必需病毒序列缺陷的野生型桿狀病毒（此病毒DNA不具備感染能力）共轉(zhuǎn)染。：（一）穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞：：L細(xì)胞、Ltk細(xì)胞、NIH 3T3細(xì)胞、Sp2/0和NSO細(xì)胞、CHO細(xì)胞等；：HEK29HeLa、HL60、HT1080等細(xì)胞； ㈡瞬時(shí)表達(dá)的細(xì)胞：COS細(xì)胞和HEK 293細(xì)胞； ㈢哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇：細(xì)胞選擇的依據(jù)主要決定于基因表達(dá)的目的。八、外源基因的表達(dá)：酵母、昆蟲（果蠅與非果蠅類）、哺乳動(dòng)物。端可進(jìn)行修飾；7）引物與非擴(kuò)增序列同源性應(yīng)70%或連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)；8）擴(kuò)增編碼區(qū)中,引物3 39。引物的常用濃度范圍：～1μmol/L，在100μl中引物的量為25～100 pmol, 假如用25μmol/L濃度的引物貯備液只需加1～ 4μl。：(1)．DNA模板變性 (denature)：95℃左右高溫使模板DNA完全變性。，隨機(jī)引物標(biāo)記法，DNA的3′末端標(biāo)記等均為延長核苷酸的反應(yīng)，而且要讓32P進(jìn)入鏈中，故應(yīng)選擇[α32P]dNTP， 50μci/反應(yīng)，無特殊原因首選[α32P]dCTP。 缺點(diǎn)：1）靈敏度不太高；2）特異性不太高。(3).具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，能耐較高溫度和保存時(shí)間。 不同點(diǎn)：(變性方法) Northern印跡雜交：聚乙二醛、二甲亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞。：1）限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)添加法； 2）T/A克隆法：1）粘性末端連接法：適用于插入片段和載體具有相同的粘性末端。：催化DNA，RNA以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的 5′ 磷酸基團(tuán)水解。 ③酚/氯仿抽提，乙醇沉淀； 酶切鑒定 ：瓊脂糖凝膠電泳：大腸桿菌DNA聚合酶I大片段，缺5′→ 3′外切酶活性。 （三）按載體來源分類：質(zhì)粒載體，噬菌體載體，病毒載體，酵母人工染色體，粘性載體。 種類：兩個(gè)融合蛋白的相互作用必須借助于第三種分子，而這第三種分子可以是蛋白質(zhì)、小分子多肽