【正文】 和核酸，因而產(chǎn)生了：1）蛋白質(zhì)三雜交系統(tǒng)；2）激酶三雜交系統(tǒng)；3）小配體三雜交系統(tǒng)；4）RNA三雜交系統(tǒng)。 ：該系統(tǒng)是一項(xiàng)鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報(bào)告基因。SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個(gè)結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。(3)雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴(lài)于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無(wú)法進(jìn)行。適當(dāng)增加濃度可減少假陽(yáng)性。②如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結(jié)合，則可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。(4) 分析新基因的生物學(xué)功能。檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無(wú)需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。(2)．基因組中引入額外的報(bào)告基因LEU、TRP、HIS。 五、酵母細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)：1）酵母雙雜交；2）親和層析；3）免疫共沉淀；4）蛋白質(zhì)交聯(lián)；5）基于GFP的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究方法；6）噬菌體顯示系統(tǒng)篩選。4）條帶模糊：被降解。：1）分配層析柱象分餾柱一樣可以分成很多層，每層為一理論塔板，其高度為理論塔板高度。 ：常用的有十二烷基磺酸鈉、TritonX100、去氧膽酸鈉等。在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性，是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率。(3)溶液的pH值：決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定所帶凈電荷的多少。4. 包涵體的形成原因：表達(dá)蛋白不適當(dāng)?shù)闹虚g折疊體高濃度聚集在一起形成的不溶物。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。 缺點(diǎn)：對(duì)各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不同；這種測(cè)定方法對(duì)蛋白質(zhì)引起不可逆的變性。CDKCyclin能夠積累224。三、細(xì)胞周期調(diào)控：：1）間期：G1期 (合成前期)； S期 (DNA合成期)； G2期 (合成后期)。如HIV感染后引起CD4+T細(xì)胞凋亡而缺失。(in situ end –lableing, ISEL)：原理: ISEL的原理是基于細(xì)胞凋亡時(shí)，DNA斷裂，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）或DNA聚合酶將帶有生物素標(biāo)記的核苷酸（biotin16dUTP）摻入到斷裂的DNA的3’端，再使其與帶有辣根過(guò)氧化物酶的抗生物蛋白結(jié)合，經(jīng)DAB顯色后，便可觀(guān)察到細(xì)胞內(nèi)是否存在DNA片段端存在。如Bcl2能阻止由r射線(xiàn)和多種化療藥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。(3)細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)途徑。凋亡細(xì)胞中, caspase剪切ICDA。如果比較隨機(jī)的十個(gè)人的常染色體的非編碼區(qū),就會(huì)發(fā)現(xiàn)約200~400bp就有一個(gè)核苷酸不同,這些可變區(qū)域即稱(chēng)為DNA多態(tài)性 (DNA polymorphism)位點(diǎn)。(3). 核酸雜交技術(shù)——精確的基因定位。（五） 基因多為不連續(xù)的，被插入序列（IS）所分隔(這種現(xiàn)象稱(chēng)為斷裂基因（split gene）. 斷裂基因由內(nèi)含子（intron）（非編碼序列）和外顯子（exon）（編碼序列）交替組成。(2). 序列特征——密碼子偏愛(ài)和剪接點(diǎn)。（二）轉(zhuǎn)錄與翻譯不同步，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋樱δ芟嚓P(guān)基因分散排布，無(wú)操縱子結(jié)構(gòu)。:(1).家系分析法——發(fā)現(xiàn)感興趣的基因。第三代遺傳標(biāo)記是SNP（restriction fragment length polymorphism，單核苷酸多態(tài)性），不再是分析長(zhǎng)度，而是直接測(cè)序2）物理圖:以一段已知序列的DNA片段（STS，sequence tagged site，序列標(biāo)記位點(diǎn)）并有染色體定位為路標(biāo)，以Mb或Kb為圖距的基因組圖。：Caspase即天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶。(3).分類(lèi)：百余種凋亡調(diào)控因子，正逐漸被組裝成一條條的信息傳導(dǎo)通路，可分為基本傳導(dǎo)通路和非專(zhuān)一性傳導(dǎo)通路二類(lèi)。突變型P53蛋白：?jiǎn)适б种萍?xì)胞惡性增殖功能，p53基因突變是50%以上腫瘤逃逸凋亡的重要原因。10. Bcl2家族對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制:(1)BclBax和Bclx組成一個(gè)凋亡調(diào)控系統(tǒng)。3）除系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)?，還證實(shí)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癬均與淋巴細(xì)胞凋亡敏感性改變（Fas和FasL突變）有關(guān)。2）P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負(fù)責(zé)維持基因組的完整性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。下游蛋白質(zhì)磷酸化224。 注意事項(xiàng)：石英比色杯；調(diào)零所用溶液；配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶液；光密度范圍。4）BCA (二喹啉甲酸)檢測(cè)法：改進(jìn)的Lowry測(cè)定法，反應(yīng)簡(jiǎn)單而且?guī)缀鯖](méi)有干擾物質(zhì)的影響。(4). 離心、層析、電泳等進(jìn)一步純化。溶解包涵體（用6～8mol/L或 9～10mol/ ～）224。：(1)凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠 (stacking gel)； 分離膠 (separating gel)(2)緩沖液離子成分的不連續(xù)性：快離子(前導(dǎo)離子, leading ion)；慢離子(尾隨離子, trailing ion)；緩沖配對(duì)離子(緩沖抗衡離子,the buffer counter ion)。 ：由于在此過(guò)程中易使活性蛋白失活，故適用于提取非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。 3）根據(jù)電荷的不同分離：； 。 制備：1）原料：丙烯酰胺(Acr)和亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)；2）催化劑：引發(fā)劑（過(guò)硫酸銨, (NH4)2S2O8），加速劑（四甲基乙二胺, TEMED；3）化學(xué)聚合和光聚合兩種；4）凝膠濃度和交聯(lián)度；5）不連續(xù)系統(tǒng)制備。8）條帶彎曲：電泳過(guò)程產(chǎn)熱過(guò)多；染色、固定時(shí)間短。如果X蛋白與Y蛋白之間存在相互作用,那么分別位于這兩個(gè)融合蛋白(”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白)上的BD和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活相應(yīng)基因(報(bào)告基因)的轉(zhuǎn)錄與表達(dá). 通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè),反過(guò)來(lái)可斷別作為”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用.: (1)．易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。(1)．高敏感性。p：(1)分析已知蛋白之間的相互作用。1）假陽(yáng)性定義：在待研究的兩個(gè)蛋白間沒(méi)有發(fā)生相互作用的情況下，報(bào)告基因仍被激活。目前試劑公司已采用。雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域。，結(jié)構(gòu)域中的DNABD位于N末端，能識(shí)別位于Gal4基因的上游激活序列，AD位于C末端。①確定已知DNA蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個(gè)有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。(4)表達(dá)型載體還應(yīng)有強(qiáng)啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。(YAC)：1）酵母基因：著絲粒，端粒，自主復(fù)制順序； 2）質(zhì)粒pBR322衍生物：復(fù)制起點(diǎn)(ori)，Ampr基因。(TdT)：功能：催化多個(gè)脫氧核苷酸依次加到單鏈或雙鏈DNA分子的3′OH末端。：1）使用DNA合成儀。、轉(zhuǎn)染程序：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌――― 感受態(tài)細(xì)菌(4℃保存24h) 37℃，倒置培養(yǎng)重組質(zhì)粒DNA+細(xì)菌熱休克蛋（42度，90秒）普通培養(yǎng)基溫育涂布于含抗生素的培養(yǎng)基平板單菌落20. Southern印跡雜交是將經(jīng)凝膠分離的DNA轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物，再通過(guò)特異性探針的雜交來(lái)檢測(cè)被轉(zhuǎn)移的DNA片段的一種技術(shù)。：1）寡核苷酸探針；2）基因組DNA探針；3）cDNA探針；4）RNA探針。：優(yōu)點(diǎn)：1）靈敏度極高；2）放射性核素對(duì)各種酶促反應(yīng)無(wú)任何影響,也不會(huì)影響堿基配對(duì)的特異性與穩(wěn)定性和雜交性質(zhì)；3）極高的特異性。(4)DNA的末端標(biāo)記。：1）毛細(xì)管轉(zhuǎn)移；2）電轉(zhuǎn)移法；3）真空轉(zhuǎn)移法。端沒(méi)有固定的終止點(diǎn)。端不能有任何修飾, 3 39。底物dNTP濃度；4。2）. 附加物的選取: 附加物有表位標(biāo)簽{如(His)GST}、GFP等。1）1. 桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體結(jié)構(gòu)：多數(shù)載體由pUC質(zhì)粒改造而來(lái)，含ampr基因。3）增強(qiáng)子：能增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的DNA序列。轉(zhuǎn)錄因子之間不同方案組合，生成有活性、專(zhuān)一性的復(fù)合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。反式作用因子的作用模式：扭曲、滑動(dòng)、成環(huán)等4）中介因子對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控5）多重增強(qiáng)子作用：金屬硫蛋白基因；組合式基因調(diào)控。(2).原核表達(dá)載體的mRNA有SD序列，真核細(xì)胞無(wú)。(5) .外源基因的大小(bp數(shù)): 注意某些病毒載體對(duì)外源基因的容量。2）顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記。：1）表達(dá)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)與選擇：A）選擇適當(dāng)?shù)膹?qiáng)啟動(dòng)子；B）引入原核增強(qiáng)子樣序列；C）.設(shè)計(jì)合理的SD序列；D）.外源基因中稀有密碼子的影響，解決辦法：堿基突變和共表達(dá)稀有密碼子的tRNA基因。：(1).基因芯片技術(shù)：，雜交信號(hào)陽(yáng)性的探針序列即為細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列。：使用PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙分子自鏈模板，以線(xiàn)性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過(guò)消減和富集，使得目的基因片段得到特異性擴(kuò)增。 3）特點(diǎn)：探針量靶基因片段(量) 。3）操作步驟：；；。經(jīng)PCR擴(kuò)增出突變區(qū)的CAN片段，然后直接點(diǎn)在膜上，與相應(yīng)的寡核苷酸探針雜交，即可檢測(cè)出DNA樣品是否有突變，以及診斷受檢者是突變純合子還是雜合子。 2）α 地貧的基因型： α / αα (稱(chēng)α+ 地貧)； / αα (稱(chēng)αo 地貧). 3）α地貧的臨床類(lèi)型： （A）.Hb Bart’s 胎兒水腫綜合征：基因型 / ，稱(chēng)為α0 地貧純合子。（D）.靜止型 a地中海貧血：基因型：a / a a ( a + 地貧雜合子 )，僅缺失1個(gè)a 基因，無(wú)癥狀。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的篩選和鑒定224。：1）目標(biāo)基因?qū)氚屑?xì)胞的方法分為兩類(lèi)：病毒學(xué)方法和非病毒學(xué)方法?；蚨c(diǎn)突變、定點(diǎn)敲除和定點(diǎn)修復(fù)均屬于基因打靶(gene targeting)技術(shù)。3）核酶催化作用的特點(diǎn)：A)都有一個(gè)活性中心，催化時(shí)形成中間復(fù)合物，具有比蛋白質(zhì)酶更高的底物特異性；B)核酶對(duì)底物的切點(diǎn)處序列普遍為含GU序列。:1）抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞：；；；。(3)．雜交反應(yīng)與雜交后清洗:芯片雜交與常規(guī)分子雜交相似。分子印章(涂布)224。探針。洗脫、濃縮 、真空干燥224。受體對(duì)信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)換并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信使系統(tǒng)224。2）分為兩大類(lèi):受體型PTK—許多生長(zhǎng)因子受體；非受體型PTK,如src,abl,FAK。：1）是一個(gè)大家族,分為兩大類(lèi)：蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶。受體的結(jié)構(gòu)：高度可變區(qū)，DNA結(jié)合區(qū)，激素結(jié)合區(qū)，鉸鏈區(qū)。第二信使224。對(duì)膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能、機(jī)體代謝、基因表達(dá)、細(xì)胞分化和增殖等的調(diào)節(jié)起作用。:1) SMAD最早被證實(shí)的TβRⅠ激酶的底物,可將其歸結(jié)成三大類(lèi)：受體調(diào)節(jié)的SMADs (R SMADs), 共同的偶配體SMADs (CoSMADs), 抑制性SMADs (I。2）生理效應(yīng)：PKG使有關(guān)蛋白或酶類(lèi)的絲、蘇氨酸殘基磷酸化，如心鈉素、NO舒張血管平滑肌。酶或其他功能蛋白224。：1）磷酸化與脫磷酸化作用；2）膜磷脂的代謝的影響；3）酶促水解作用；4）Ｇ蛋白的調(diào)節(jié)。 Kinase：1）被許多GF及Oncogene激活；2）催化：PI ——PI3P。4）PTK抑制劑中可篩選抗癌藥。3. cAMP 蛋白激酶Ａ途徑：組成：胞外信息分子，受體，G蛋白，腺苷酸環(huán)化酶 (adpenylate cyclase，AC)， cAMP，蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)4. PKA：1）由四個(gè)亞基組成：R2C2 （R調(diào)節(jié)亞基，C催化亞基）；2）被cAMP激活： 3）催化多種蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸磷酸化。：1） 溫度；2）探針堿基組成及其濃度；3）靶核酸長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度；4）雜交液的組成。：1)完全互補(bǔ)性：對(duì)靶序列 的保守區(qū)而言；2)高度特異性：對(duì)基因家族的某個(gè)成員或?qū)Σ煌? 生物 種屬的同一基因而言；3)探針的豐度：針對(duì)靶基因序列設(shè)計(jì)多個(gè)(3個(gè)以上)寡核苷酸探針；4)設(shè)計(jì)單堿基錯(cuò)配即MM(mismatch)探針：作內(nèi)參照(衡量探針的特異性)。 合成反應(yīng). :1）芯片的雜交類(lèi)型：固液相雜交(固相：探針；液相：靶分子核酸)。 (5)結(jié)果與討論：(一)顯微光蝕刻技術(shù)：經(jīng)化學(xué)處理,支持物表面活性羥基(OH) 連接光敏保護(hù)基(X) 選用光刻掩模(M1)保護(hù)非聚合部位224。3）調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。2）ADA缺陷導(dǎo)致SCID的分子機(jī)制：ADA或PNP缺失導(dǎo)致dATP或dGTP在細(xì)胞內(nèi)積蓄，對(duì)早期T、B細(xì)胞發(fā)育有毒性作用，使之停滯于proT/proB階段，引起嚴(yán)重聯(lián)合型免疫缺陷（SCID）.3）基因治療研究：ADAgene + vector （逆轉(zhuǎn)錄病毒）224。3）基因干預(yù) 是指采用特定的手段，抑制或阻斷某個(gè)基因的表達(dá)。：1）逆轉(zhuǎn)錄病毒科是RNA病毒。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便；缺點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的效率都較低。：1）Southern印跡雜交及限制性酶譜分析法：A）.α和ζ珠蛋白基因探針制備；B）內(nèi)切酶譜結(jié)果鑒定。Hb Bart對(duì)氧的親和力極高，造成組織嚴(yán)重缺氧, 導(dǎo)致胎兒水腫, 引起死胎或新生兒死亡。：初篩用PCRSSCP分析法； 確認(rèn)用DNA 測(cè)序。2）應(yīng)用：廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(cè)(初篩)。4）應(yīng)用：用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因表達(dá)譜的研究等。（SSH）：1）具體過(guò)程：第一階段：與RDA法類(lèi)似，用識(shí)別4堿基的限制酶(如Hae Ⅲ 等)消化實(shí)驗(yàn)組(Tester)與驅(qū)動(dòng)組(Driver)cDNA ,得到平末端cDNA短片段；第二階段： 實(shí)驗(yàn)組cDNA均分為兩份,分別加接頭1和接頭2，各自與過(guò)量的驅(qū)動(dòng)組cDNA酶切片段雜交，雜交產(chǎn)物混合后再與驅(qū)動(dòng)組新的cDNA酶切片段進(jìn)行第二輪雜交，產(chǎn)物補(bǔ)平后作為模板，加引物作2次PCR擴(kuò)增。：靈敏度高，不需測(cè)序，操作時(shí)間短。3）提高外源蛋白的穩(wěn)定性：A）.利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目的蛋白積累在間周質(zhì)或分泌到胞外。4）外源基因下游應(yīng)加入不依賴(lài)于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。：1）優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清楚、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短。(4).原核細(xì)胞缺乏蛋白質(zhì)翻譯后加工的能力；若要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要糖基化及高級(jí)結(jié)構(gòu)，應(yīng)采用真核表達(dá)系統(tǒng)。 2）Poly(A)尾的作用：延長(zhǎng)mRNA的半衰期限； 促進(jìn)翻譯效率。：要通過(guò)調(diào)節(jié)反式作用因子的活性控制轉(zhuǎn)錄起始。 作用機(jī)制：可能通過(guò)與某些調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。 2）