【正文】 和核酸，因而產(chǎn)生了：1）蛋白質(zhì)三雜交系統(tǒng)；2）激酶三雜交系統(tǒng)；3）小配體三雜交系統(tǒng)；4）RNA三雜交系統(tǒng)。 ：該系統(tǒng)是一項鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術，核心在于構建一種反向篩選的報告基因。SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個結合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。(3)雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應在核內(nèi)無法進行。適當增加濃度可減少假陽性。②如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結合，則可單獨激活報告基因的表達。(4) 分析新基因的生物學功能。檢測在活細胞內(nèi)進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。(2)．基因組中引入額外的報告基因LEU、TRP、HIS。 五、酵母細胞雙雜交系統(tǒng)：1）酵母雙雜交；2）親和層析；3）免疫共沉淀；4）蛋白質(zhì)交聯(lián)；5）基于GFP的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究方法；6）噬菌體顯示系統(tǒng)篩選。4）條帶模糊：被降解。：1）分配層析柱象分餾柱一樣可以分成很多層，每層為一理論塔板，其高度為理論塔板高度。 ：常用的有十二烷基磺酸鈉、TritonX100、去氧膽酸鈉等。在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性，是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率。(3)溶液的pH值：決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定所帶凈電荷的多少。4. 包涵體的形成原因：表達蛋白不適當?shù)闹虚g折疊體高濃度聚集在一起形成的不溶物。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計算蛋白質(zhì)的含量。 缺點：對各種純化蛋白質(zhì)反應不同；這種測定方法對蛋白質(zhì)引起不可逆的變性。CDKCyclin能夠積累224。三、細胞周期調(diào)控：：1）間期：G1期 (合成前期)； S期 (DNA合成期)； G2期 (合成后期)。如HIV感染后引起CD4+T細胞凋亡而缺失。(in situ end –lableing, ISEL)：原理: ISEL的原理是基于細胞凋亡時，DNA斷裂，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）或DNA聚合酶將帶有生物素標記的核苷酸（biotin16dUTP）摻入到斷裂的DNA的3’端，再使其與帶有辣根過氧化物酶的抗生物蛋白結合，經(jīng)DAB顯色后，便可觀察到細胞內(nèi)是否存在DNA片段端存在。如Bcl2能阻止由r射線和多種化療藥導致的細胞凋亡。(3)細胞核凋亡誘導途徑。凋亡細胞中, caspase剪切ICDA。如果比較隨機的十個人的常染色體的非編碼區(qū),就會發(fā)現(xiàn)約200~400bp就有一個核苷酸不同,這些可變區(qū)域即稱為DNA多態(tài)性 (DNA polymorphism)位點。(3). 核酸雜交技術——精確的基因定位。（五） 基因多為不連續(xù)的，被插入序列（IS）所分隔(這種現(xiàn)象稱為斷裂基因（split gene）. 斷裂基因由內(nèi)含子（intron）（非編碼序列）和外顯子（exon）（編碼序列）交替組成。(2). 序列特征——密碼子偏愛和剪接點。（二）轉(zhuǎn)錄與翻譯不同步，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，功能相關基因分散排布，無操縱子結構。:(1).家系分析法——發(fā)現(xiàn)感興趣的基因。第三代遺傳標記是SNP（restriction fragment length polymorphism，單核苷酸多態(tài)性），不再是分析長度，而是直接測序2）物理圖:以一段已知序列的DNA片段（STS，sequence tagged site，序列標記位點）并有染色體定位為路標，以Mb或Kb為圖距的基因組圖。：Caspase即天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶。(3).分類：百余種凋亡調(diào)控因子，正逐漸被組裝成一條條的信息傳導通路，可分為基本傳導通路和非專一性傳導通路二類。突變型P53蛋白：喪失抑制細胞惡性增殖功能，p53基因突變是50%以上腫瘤逃逸凋亡的重要原因。10. Bcl2家族對細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制:(1)BclBax和Bclx組成一個凋亡調(diào)控系統(tǒng)。3）除系統(tǒng)性紅斑狼瘡外，還證實類風濕性關節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癬均與淋巴細胞凋亡敏感性改變（Fas和FasL突變）有關。2）P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負責維持基因組的完整性、DNA損傷修復和細胞周期的正常運轉(zhuǎn)。下游蛋白質(zhì)磷酸化224。 注意事項：石英比色杯；調(diào)零所用溶液；配制標準蛋白所用溶液；光密度范圍。4）BCA (二喹啉甲酸)檢測法：改進的Lowry測定法，反應簡單而且?guī)缀鯖]有干擾物質(zhì)的影響。(4). 離心、層析、電泳等進一步純化。溶解包涵體（用6～8mol/L或 9～10mol/ ～）224。：(1)凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠 (stacking gel)； 分離膠 (separating gel)(2)緩沖液離子成分的不連續(xù)性：快離子(前導離子, leading ion)；慢離子(尾隨離子, trailing ion)；緩沖配對離子(緩沖抗衡離子,the buffer counter ion)。 ：由于在此過程中易使活性蛋白失活，故適用于提取非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。 3）根據(jù)電荷的不同分離：； 。 制備：1）原料：丙烯酰胺(Acr)和亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)；2）催化劑：引發(fā)劑（過硫酸銨, (NH4)2S2O8），加速劑（四甲基乙二胺, TEMED；3）化學聚合和光聚合兩種；4）凝膠濃度和交聯(lián)度；5）不連續(xù)系統(tǒng)制備。8）條帶彎曲：電泳過程產(chǎn)熱過多；染色、固定時間短。如果X蛋白與Y蛋白之間存在相互作用,那么分別位于這兩個融合蛋白(”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白)上的BD和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活相應基因(報告基因)的轉(zhuǎn)錄與表達. 通過對報告基因表達產(chǎn)物的檢測,反過來可斷別作為”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用.: (1)．易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒。(1)．高敏感性。p：(1)分析已知蛋白之間的相互作用。1）假陽性定義：在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報告基因仍被激活。目前試劑公司已采用。雙雜交前刪除該部分，但應避免刪除相互作用的結構域。，結構域中的DNABD位于N末端，能識別位于Gal4基因的上游激活序列，AD位于C末端。①確定已知DNA蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補充，提出了創(chuàng)建整個有機體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設想。(4)表達型載體還應有強啟動子、前導序列、增強子等調(diào)控元件。(YAC)：1）酵母基因：著絲粒，端粒，自主復制順序； 2）質(zhì)粒pBR322衍生物：復制起點(ori)，Ampr基因。(TdT)：功能：催化多個脫氧核苷酸依次加到單鏈或雙鏈DNA分子的3′OH末端。：1）使用DNA合成儀。、轉(zhuǎn)染程序：對數(shù)生長期的細菌――― 感受態(tài)細菌(4℃保存24h) 37℃，倒置培養(yǎng)重組質(zhì)粒DNA+細菌熱休克蛋（42度，90秒）普通培養(yǎng)基溫育涂布于含抗生素的培養(yǎng)基平板單菌落20. Southern印跡雜交是將經(jīng)凝膠分離的DNA轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物，再通過特異性探針的雜交來檢測被轉(zhuǎn)移的DNA片段的一種技術。：1）寡核苷酸探針；2）基因組DNA探針；3）cDNA探針；4）RNA探針。：優(yōu)點：1）靈敏度極高；2）放射性核素對各種酶促反應無任何影響,也不會影響堿基配對的特異性與穩(wěn)定性和雜交性質(zhì)；3）極高的特異性。(4)DNA的末端標記。：1）毛細管轉(zhuǎn)移；2）電轉(zhuǎn)移法；3）真空轉(zhuǎn)移法。端沒有固定的終止點。端不能有任何修飾, 3 39。底物dNTP濃度；4。2）. 附加物的選取: 附加物有表位標簽{如(His)GST}、GFP等。1）1. 桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體結構：多數(shù)載體由pUC質(zhì)粒改造而來，含ampr基因。3）增強子：能增強啟動子活性的DNA序列。轉(zhuǎn)錄因子之間不同方案組合，生成有活性、專一性的復合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對性地結合、轉(zhuǎn)錄相應的基因。反式作用因子的作用模式：扭曲、滑動、成環(huán)等4）中介因子對轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控5）多重增強子作用：金屬硫蛋白基因；組合式基因調(diào)控。(2).原核表達載體的mRNA有SD序列，真核細胞無。(5) .外源基因的大小(bp數(shù)): 注意某些病毒載體對外源基因的容量。2）顯性的轉(zhuǎn)化篩選標記。：1）表達載體的優(yōu)化設計與選擇：A）選擇適當?shù)膹妴幼?；B）引入原核增強子樣序列；C）.設計合理的SD序列；D）.外源基因中稀有密碼子的影響，解決辦法：堿基突變和共表達稀有密碼子的tRNA基因。：(1).基因芯片技術：，雜交信號陽性的探針序列即為細胞中表達的DNA序列。：使用PCR以指數(shù)形式擴增雙分子自鏈模板，以線性形式擴增單鏈模板的特性，通過消減和富集，使得目的基因片段得到特異性擴增。 3）特點：探針量靶基因片段(量) 。3）操作步驟：；；。經(jīng)PCR擴增出突變區(qū)的CAN片段，然后直接點在膜上，與相應的寡核苷酸探針雜交，即可檢測出DNA樣品是否有突變，以及診斷受檢者是突變純合子還是雜合子。 2）α 地貧的基因型： α / αα (稱α+ 地貧)； / αα (稱αo 地貧). 3）α地貧的臨床類型： （A）.Hb Bart’s 胎兒水腫綜合征：基因型 / ，稱為α0 地貧純合子。（D）.靜止型 a地中海貧血：基因型：a / a a ( a + 地貧雜合子 )，僅缺失1個a 基因，無癥狀。轉(zhuǎn)導細胞的篩選和鑒定224。：1）目標基因?qū)氚屑毎姆椒ǚ譃閮深悾翰《緦W方法和非病毒學方法?；蚨c突變、定點敲除和定點修復均屬于基因打靶(gene targeting)技術。3）核酶催化作用的特點：A)都有一個活性中心，催化時形成中間復合物，具有比蛋白質(zhì)酶更高的底物特異性；B)核酶對底物的切點處序列普遍為含GU序列。:1）抑制和殺傷腫瘤細胞：；；；。(3)．雜交反應與雜交后清洗:芯片雜交與常規(guī)分子雜交相似。分子印章(涂布)224。探針。洗脫、濃縮 、真空干燥224。受體對信號進行轉(zhuǎn)換并啟動細胞內(nèi)信使系統(tǒng)224。2）分為兩大類:受體型PTK—許多生長因子受體；非受體型PTK,如src,abl,FAK。：1）是一個大家族,分為兩大類：蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶。受體的結構：高度可變區(qū)，DNA結合區(qū)，激素結合區(qū)，鉸鏈區(qū)。第二信使224。對膜離子轉(zhuǎn)運功能、機體代謝、基因表達、細胞分化和增殖等的調(diào)節(jié)起作用。:1) SMAD最早被證實的TβRⅠ激酶的底物,可將其歸結成三大類：受體調(diào)節(jié)的SMADs (R SMADs), 共同的偶配體SMADs (CoSMADs), 抑制性SMADs (I。2）生理效應：PKG使有關蛋白或酶類的絲、蘇氨酸殘基磷酸化，如心鈉素、NO舒張血管平滑肌。酶或其他功能蛋白224。：1）磷酸化與脫磷酸化作用；2）膜磷脂的代謝的影響；3）酶促水解作用；4）Ｇ蛋白的調(diào)節(jié)。 Kinase：1）被許多GF及Oncogene激活；2）催化：PI ——PI3P。4）PTK抑制劑中可篩選抗癌藥。3. cAMP 蛋白激酶Ａ途徑：組成：胞外信息分子，受體，G蛋白，腺苷酸環(huán)化酶 (adpenylate cyclase，AC)， cAMP，蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)4. PKA：1）由四個亞基組成：R2C2 （R調(diào)節(jié)亞基，C催化亞基）；2）被cAMP激活： 3）催化多種蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸磷酸化。：1） 溫度；2）探針堿基組成及其濃度；3）靶核酸長度、堿基組成及其濃度；4）雜交液的組成。：1)完全互補性：對靶序列 的保守區(qū)而言；2)高度特異性：對基因家族的某個成員或?qū)Σ煌? 生物 種屬的同一基因而言；3)探針的豐度：針對靶基因序列設計多個(3個以上)寡核苷酸探針；4)設計單堿基錯配即MM(mismatch)探針：作內(nèi)參照(衡量探針的特異性)。 合成反應. :1）芯片的雜交類型：固液相雜交(固相：探針；液相：靶分子核酸)。 (5)結果與討論：(一)顯微光蝕刻技術：經(jīng)化學處理,支持物表面活性羥基(OH) 連接光敏保護基(X) 選用光刻掩模(M1)保護非聚合部位224。3）調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能。2）ADA缺陷導致SCID的分子機制：ADA或PNP缺失導致dATP或dGTP在細胞內(nèi)積蓄，對早期T、B細胞發(fā)育有毒性作用，使之停滯于proT/proB階段，引起嚴重聯(lián)合型免疫缺陷（SCID）.3）基因治療研究：ADAgene + vector （逆轉(zhuǎn)錄病毒）224。3）基因干預 是指采用特定的手段，抑制或阻斷某個基因的表達。：1）逆轉(zhuǎn)錄病毒科是RNA病毒。優(yōu)點：操作簡便；缺點：基因轉(zhuǎn)移和表達的效率都較低。：1）Southern印跡雜交及限制性酶譜分析法：A）.α和ζ珠蛋白基因探針制備；B）內(nèi)切酶譜結果鑒定。Hb Bart對氧的親和力極高，造成組織嚴重缺氧, 導致胎兒水腫, 引起死胎或新生兒死亡。：初篩用PCRSSCP分析法； 確認用DNA 測序。2）應用：廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。4）應用：用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因表達譜的研究等。（SSH）：1）具體過程：第一階段：與RDA法類似，用識別4堿基的限制酶(如Hae Ⅲ 等)消化實驗組(Tester)與驅(qū)動組(Driver)cDNA ,得到平末端cDNA短片段；第二階段： 實驗組cDNA均分為兩份,分別加接頭1和接頭2，各自與過量的驅(qū)動組cDNA酶切片段雜交，雜交產(chǎn)物混合后再與驅(qū)動組新的cDNA酶切片段進行第二輪雜交，產(chǎn)物補平后作為模板，加引物作2次PCR擴增。：靈敏度高，不需測序，操作時間短。3）提高外源蛋白的穩(wěn)定性：A）.利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)把目的蛋白積累在間周質(zhì)或分泌到胞外。4）外源基因下游應加入不依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。：1）優(yōu)點：遺傳背景清楚、目的基因表達水平高、培養(yǎng)周期短。(4).原核細胞缺乏蛋白質(zhì)翻譯后加工的能力；若要表達的蛋白質(zhì)需要糖基化及高級結構，應采用真核表達系統(tǒng)。 2）Poly(A)尾的作用：延長mRNA的半衰期限； 促進翻譯效率。：要通過調(diào)節(jié)反式作用因子的活性控制轉(zhuǎn)錄起始。 作用機制：可能通過與某些調(diào)節(jié)蛋白的結合改變?nèi)旧|(zhì)的結構而發(fā)揮作用。 2）