分子生物學總復習(編輯修改稿)
2025-07-04 15:52 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 對，引起隨后復制中發(fā)生GC向AT轉換。216。 烷化劑：如甲烷磺酸甲酯（methylmethanesulfonate，MMS）、乙基亞硝基尿（ethylnitrosourea，ENU）及芳基化劑須經(jīng)修復才能防止給轉錄及復制過程帶來嚴重破壞216。 嵌入劑：會產(chǎn)生插入突變和缺失突變。絕大部分化學誘變劑是致癌劑，誘發(fā)癌癥某些物理化學因子，如紫外線、電離輻射和化學誘變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機理是作用于DNA，造成DNA結構和功能的破壞，稱為DNA的損傷8．簡述DNA復制的忠實性9．誘變劑的類型與作用10．DNA的修復：？？？六、PPT1DNA克?。和ㄟ^將生物體基因組DNA片段作為自主復制載體的一部分進行獨立復制的方式，使對該片段的分離及操作簡單化。解決這一難題的方法是將基因組中攜有該基因或其他相關序列的較小片段連接到一段可以自主復制的DNA即載體上，形成通常可以在另一宿主中進行復制的重組DNA，這種復制是獨立于原初基因組的。帶有重組DNA的宿主細胞的增殖構成了一群具有遺傳一致性的個體，或稱為單克隆。這一系列操作過程就被稱作DNA克隆。細菌質粒：是獨立于宿主基因組復制、編碼抗生素抗性基因的小型環(huán)狀DNA分子、運載克隆DNA的常用載體轉化： 用含Ca2+的溶液處理的大腸桿菌細胞會易于吸收外源DNA，這一過程被稱為轉化：轉化率： 轉化率定義為每毫克轉化的質粒DNA所產(chǎn)生的具抗生素抗性的克隆數(shù)。轉染：DNA轉入真核細胞的過程，稱轉染。雜交扣留：cDNA克隆可與mRNA樣品進行雜交以阻止或抑制某些mRNA隨后的翻譯。密碼子(codon)：mRNA上每3個相鄰的核苷酸編碼蛋白質多肽鏈中的一個氨基酸，這三個核苷酸就稱為一個密碼子或三聯(lián)體密碼。遺傳密碼： DNA（或mRNA）中的核苷酸序列與蛋白質中氨基酸序列之間的對應關系稱為遺傳密碼。PPT63質粒特點：染色體外的小型環(huán)狀分子，大小約為2—200kb，通常以多拷貝(可多達幾百個)形式存在于宿主細胞中。質粒含有復制起點(ori)用以保證質粒的自主復制正常復制依賴宿主細胞中的聚合酶及其他成分。質粒一般僅攜有幾個基因抗生素物質的抗性基因。質粒最常見的抗性基因是amp+基因（氨芐青霉素）和另一種常見抗性基因是tetA基因。質粒提取的原理：1）裂解：菌體沉淀重懸于懸浮緩沖液→（能降解菌體細胞壁）→，含去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的堿性NaOH溶液。SDS的作用是破碎細胞膜及引起蛋白質變性；堿性條件會引起DNA變性及水解RNA。2）中和沉淀蛋白：用高濃度pH5的乙酸鉀溶液中和。其作用是沉淀已變性蛋白質和染色體DNA及大部分去污劑(十二烷基硫酸鉀不溶于水) →再次離心→上清(裂解液)中含有質粒DNA（小型閉合環(huán)狀的質粒DNA在堿處理后很易復性）→此時的溶液中還含有大量小分子RNA及少量蛋白質。3）酚抽提：去除剩余蛋白。酚相與水相不相溶，當劇烈振蕩然后靜置或離心分相后，變性了的殘余蛋白會沉降出來處于酚相與水相的界面。 4）乙醇沉淀：留在水相中的DNA和RNA可由無水乙醇沉淀得以濃縮。這是常用程序，可應用于任何核酸溶液。異丙醇也可沉淀核酸。75%乙醇洗1－2次，去除核酸中的雜質。5）離心沉淀核酸，干燥后再溶于更少的體積，或溶于含新成分的緩沖液中。溶液中含TrisHCl以緩沖溶液酸堿度(通常為pH8)，還含有低濃度的EDTA用來螯合Mg2+以保護DNA免受核酸酶降解，因大多數(shù)核酸酶工作都需要Mg2+。核糖核酸酶A(RNaseA)可同時被加入溶液中以降解殘余的RNA污染。該酶降解RNA又不損傷DNA，也不需Mg2+參與反應。 6）小量法制備質粒的過程（一般掌握）攜有目的質粒的大腸桿菌菌株↓數(shù)毫升液體培養(yǎng)基（LB）↓增殖至穩(wěn)定期(過夜培養(yǎng))↓離心↓菌體沉淀↓小量制備法提取質粒隨機挑取生長于LB平板上的數(shù)個白色的菌落分別接種于含100μg/ml Amp 的LB液體培基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。 ml培養(yǎng)液微量離心管中，10000g離心30秒，盡棄上清，將沉淀重懸于100μl預冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L TrisHCl ，10mmol/L EDTA)中，劇烈振蕩以分散沉淀的細胞；再加入200 μl新配制溶液II(，1%SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配)，快速顛倒離心管數(shù)次以混合內(nèi)容物，確保整個內(nèi)表面與溶液II接觸；然后加入150 μl溶液III(5mol/L KAc 60ml，冰醋酸 ，H20 )，溫和振蕩數(shù)次，使溶液III 分散均勻，置冰上3~5分鐘后，4℃12000g離心10分鐘，取上清加入等體積的酚/氯仿、氯仿各抽提一次，取上層水相加入2倍體積的無水乙醇20℃沉淀30分鐘，4℃ 12000g離心15分鐘，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次后真空干燥。沉淀用適量含RNA酶(20μg/ml) TE(10mmol/L TrisHCl,)溶解，37℃作用15分鐘。取2μl進行瓊脂糖電泳分析。 乙二醇法純化方法：取3 ml冰預冷的5mol/L LiCl 溶液加到上述制備的質粒DNA溶液中，充分混勻后12000 g 4 ℃離心10分鐘。棄沉淀，將上清轉移到另一個離心管中，加入等體積的異丙醇充分混勻后，8000 g室溫離心10分鐘。小心去掉上清，倒置離心管控干殘留液滴，于室溫下70%乙醇洗滌，干燥后，加入500 μl 含RNA酶(20μg/ml)的TE溶解沉淀。 ml Eppendorf 小管，置室溫作用30分鐘后，加入500 μl含13%（W/V），充分混勻。12000 g 4oC離心10分鐘，吸出上清，加400 μl TE
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