分子生物學(xué)總復(fù)習(xí)(編輯修改稿)
2025-07-04 15:52 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 對(duì)，引起隨后復(fù)制中發(fā)生GC向AT轉(zhuǎn)換。216。 烷化劑：如甲烷磺酸甲酯（methylmethanesulfonate，MMS）、乙基亞硝基尿（ethylnitrosourea，ENU）及芳基化劑須經(jīng)修復(fù)才能防止給轉(zhuǎn)錄及復(fù)制過(guò)程帶來(lái)嚴(yán)重破壞216。 嵌入劑：會(huì)產(chǎn)生插入突變和缺失突變。絕大部分化學(xué)誘變劑是致癌劑，誘發(fā)癌癥某些物理化學(xué)因子，如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機(jī)理是作用于DNA，造成DNA結(jié)構(gòu)和功能的破壞，稱為DNA的損傷8．簡(jiǎn)述DNA復(fù)制的忠實(shí)性9．誘變劑的類型與作用10．DNA的修復(fù)：？？？六、PPT1DNA克?。和ㄟ^(guò)將生物體基因組DNA片段作為自主復(fù)制載體的一部分進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的方式，使對(duì)該片段的分離及操作簡(jiǎn)單化。解決這一難題的方法是將基因組中攜有該基因或其他相關(guān)序列的較小片段連接到一段可以自主復(fù)制的DNA即載體上，形成通?？梢栽诹硪凰拗髦羞M(jìn)行復(fù)制的重組DNA，這種復(fù)制是獨(dú)立于原初基因組的。帶有重組DNA的宿主細(xì)胞的增殖構(gòu)成了一群具有遺傳一致性的個(gè)體，或稱為單克隆。這一系列操作過(guò)程就被稱作DNA克隆。細(xì)菌質(zhì)粒：是獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制、編碼抗生素抗性基因的小型環(huán)狀DNA分子、運(yùn)載克隆DNA的常用載體轉(zhuǎn)化： 用含Ca2+的溶液處理的大腸桿菌細(xì)胞會(huì)易于吸收外源DNA，這一過(guò)程被稱為轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化率： 轉(zhuǎn)化率定義為每毫克轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA所產(chǎn)生的具抗生素抗性的克隆數(shù)。轉(zhuǎn)染：DNA轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞的過(guò)程，稱轉(zhuǎn)染。雜交扣留：cDNA克隆可與mRNA樣品進(jìn)行雜交以阻止或抑制某些mRNA隨后的翻譯。密碼子(codon)：mRNA上每3個(gè)相鄰的核苷酸編碼蛋白質(zhì)多肽鏈中的一個(gè)氨基酸，這三個(gè)核苷酸就稱為一個(gè)密碼子或三聯(lián)體密碼。遺傳密碼： DNA（或mRNA）中的核苷酸序列與蛋白質(zhì)中氨基酸序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系稱為遺傳密碼。PPT63質(zhì)粒特點(diǎn)：染色體外的小型環(huán)狀分子，大小約為2—200kb，通常以多拷貝(可多達(dá)幾百個(gè))形式存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒含有復(fù)制起點(diǎn)(ori)用以保證質(zhì)粒的自主復(fù)制正常復(fù)制依賴宿主細(xì)胞中的聚合酶及其他成分。質(zhì)粒一般僅攜有幾個(gè)基因抗生素物質(zhì)的抗性基因。質(zhì)粒最常見(jiàn)的抗性基因是amp+基因（氨芐青霉素）和另一種常見(jiàn)抗性基因是tetA基因。質(zhì)粒提取的原理：1）裂解：菌體沉淀重懸于懸浮緩沖液→（能降解菌體細(xì)胞壁）→，含去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的堿性NaOH溶液。SDS的作用是破碎細(xì)胞膜及引起蛋白質(zhì)變性；堿性條件會(huì)引起DNA變性及水解RNA。2）中和沉淀蛋白：用高濃度pH5的乙酸鉀溶液中和。其作用是沉淀已變性蛋白質(zhì)和染色體DNA及大部分去污劑(十二烷基硫酸鉀不溶于水) →再次離心→上清(裂解液)中含有質(zhì)粒DNA（小型閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA在堿處理后很易復(fù)性）→此時(shí)的溶液中還含有大量小分子RNA及少量蛋白質(zhì)。3）酚抽提：去除剩余蛋白。酚相與水相不相溶，當(dāng)劇烈振蕩然后靜置或離心分相后，變性了的殘余蛋白會(huì)沉降出來(lái)處于酚相與水相的界面。 4）乙醇沉淀：留在水相中的DNA和RNA可由無(wú)水乙醇沉淀得以濃縮。這是常用程序，可應(yīng)用于任何核酸溶液。異丙醇也可沉淀核酸。75%乙醇洗1－2次，去除核酸中的雜質(zhì)。5）離心沉淀核酸，干燥后再溶于更少的體積，或溶于含新成分的緩沖液中。溶液中含TrisHCl以緩沖溶液酸堿度(通常為pH8)，還含有低濃度的EDTA用來(lái)螯合Mg2+以保護(hù)DNA免受核酸酶降解，因大多數(shù)核酸酶工作都需要Mg2+。核糖核酸酶A(RNaseA)可同時(shí)被加入溶液中以降解殘余的RNA污染。該酶降解RNA又不損傷DNA，也不需Mg2+參與反應(yīng)。 6）小量法制備質(zhì)粒的過(guò)程（一般掌握）攜有目的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株↓數(shù)毫升液體培養(yǎng)基（LB）↓增殖至穩(wěn)定期(過(guò)夜培養(yǎng))↓離心↓菌體沉淀↓小量制備法提取質(zhì)粒隨機(jī)挑取生長(zhǎng)于LB平板上的數(shù)個(gè)白色的菌落分別接種于含100μg/ml Amp 的LB液體培基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 ml培養(yǎng)液微量離心管中，10000g離心30秒，盡棄上清，將沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L TrisHCl ，10mmol/L EDTA)中，劇烈振蕩以分散沉淀的細(xì)胞；再加入200 μl新配制溶液II(，1%SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配)，快速顛倒離心管數(shù)次以混合內(nèi)容物，確保整個(gè)內(nèi)表面與溶液II接觸；然后加入150 μl溶液III(5mol/L KAc 60ml，冰醋酸 ，H20 )，溫和振蕩數(shù)次，使溶液III 分散均勻，置冰上3~5分鐘后，4℃12000g離心10分鐘，取上清加入等體積的酚/氯仿、氯仿各抽提一次，取上層水相加入2倍體積的無(wú)水乙醇20℃沉淀30分鐘，4℃ 12000g離心15分鐘，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次后真空干燥。沉淀用適量含RNA酶(20μg/ml) TE(10mmol/L TrisHCl,)溶解，37℃作用15分鐘。取2μl進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。 乙二醇法純化方法：取3 ml冰預(yù)冷的5mol/L LiCl 溶液加到上述制備的質(zhì)粒DNA溶液中，充分混勻后12000 g 4 ℃離心10分鐘。棄沉淀，將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，加入等體積的異丙醇充分混勻后，8000 g室溫離心10分鐘。小心去掉上清，倒置離心管控干殘留液滴，于室溫下70%乙醇洗滌，干燥后，加入500 μl 含RNA酶(20μg/ml)的TE溶解沉淀。 ml Eppendorf 小管，置室溫作用30分鐘后，加入500 μl含13%（W/V），充分混勻。12000 g 4oC離心10分鐘，吸出上清，加400 μl TE
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