【正文】 DNA sequencing gel showing the separation of fragments in the four sequencing reactions (one per lane). 216。dsDNA變性 → 與 1條標(biāo)記引物退火 → 在 4個(gè)反應(yīng)管中分別加入dNTP和 1種雙脫氧核苷酸 →DNA 聚合反應(yīng) → 反應(yīng)產(chǎn)物變性電泳→ 凝膠干燥 → 放射自顯影 → 序列讀取。 核苷酸序列分析酶法測序 (Sanger) 化學(xué)測序法 (MaxamGilbert) 待測 DNA片段 待測 DNA片段 ↓ ↓ 次克隆 5’末端標(biāo)記 ↓ 篩選重組子 鏈分離 限制酶切 ↓ 模板增殖與純化 ↓ ↓ 純化標(biāo)記的 ssDNA 與引物退火 ↓ ↓ 定序反應(yīng) 定序反應(yīng) ↓ 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ↓ 真空干燥 ↓ 放射自顯影 ↓ 閱讀序列和計(jì)算機(jī)錄入 ↓ 核苷酸序列的分析與比較 Sanger雙脫氧核苷酸鏈終止法雙脫氧核苷酸鏈終止法 （ 1）原理： 雙脫氧（ 2′， 3′） 核苷酸可以象 2′脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的 DNA鏈中，但因 3′ 端不具 OH基，DNA鏈合成至此終止。 核酸序列分析 : 即核酸一級結(jié)構(gòu)的測定。216。例題 2: 如何利用網(wǎng)絡(luò)技術(shù)和 DNA分析軟件設(shè)計(jì)簡并引物 , 以 PCR擴(kuò)增某蛋白的 cDNA?演示 : (1)登錄 NCBI等網(wǎng)站 ,收集有關(guān) cDNA序列信息 。 定向克隆應(yīng)用舉例 PCR引物設(shè)計(jì)粗毛栓菌熱激蛋白 cDNA PCR擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì) :5′CTTCCACGACGCTATC//GAGAGATTCGCCTGCA 3′216。⑦ 特異性：與數(shù)據(jù)庫中的其它序列無明顯同源性。⑤ 引物 3ˊ 末端堿基，應(yīng)與模板單鏈 嚴(yán)格 配對。避免 5個(gè)以上相同堿基的成串排列。② 引物擴(kuò)增跨度：以 200500bp為宜。1個(gè) PCR循環(huán)產(chǎn)生 2條雙鏈分子PCR的基本原理模板 DNAPCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過程? PCR的特點(diǎn)引物 1引物 2PCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過程? PCR的特點(diǎn)引物 1引物 2Taq酶Taq酶PCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過程? PCR的特點(diǎn)第 1輪結(jié)束PCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過程? PCR的特點(diǎn)TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過程? PCR的特點(diǎn)第 2輪結(jié)束? PCR反應(yīng)條件? PCR過程? PCR的特點(diǎn)重復(fù) 30輪后230=1,073,741,824第 1輪擴(kuò)增第 2輪擴(kuò)增第 3輪擴(kuò)增第 4輪擴(kuò)增 第 5輪擴(kuò)增第 6輪擴(kuò)增電泳分析PCR設(shè)備電泳分析（ 3） PCR的應(yīng)用? 反向 PCR： 擴(kuò)增已知序列旁側(cè)的未知 DNA序列 ? 錨定 PCR: 用于測定基因結(jié)構(gòu)? 不對稱 PCR: 用于擴(kuò)增某一單鏈模板? RTPCR(逆轉(zhuǎn)錄 PCR): 逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合 PCR以擴(kuò)增 cDNA? 復(fù)合 PCR: 用多對引物同時(shí)擴(kuò)增幾條 DNA片段? 易錯(cuò) PCR： 引入 錯(cuò)配 堿基，導(dǎo)致隨機(jī)突變? 熒光定量 PCR: 用于估計(jì)模板 DNA的濃度? 免疫 PCR： 擴(kuò)增抗原 抗體復(fù)合物上的 DNA分子 ? 原位 PCR： 在組織或細(xì)胞標(biāo)本片上直接進(jìn)行 PCR? 微生物 PCR: 用于微生物的鑒定和分類216。3’3’5’Primer 1Primer 25’3’5’5’3’5’ 3’3’Taq DNAPolymerase③ 引物的延伸： DNA模板 引物結(jié)合物在 Taq DNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對原則，合成一條新的與模板 DNA互補(bǔ)的鏈。① 模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 94℃ 左右一定時(shí)間后，使模板 DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便與引物結(jié)合。注 : Taq來自 Thermus aquaticus PCR儀 PCR反應(yīng)體系 Tmplate DNA DNA Primers dNTPs Taq DNA Polymerase 10 Buffer 基本反應(yīng)步驟 1個(gè)循環(huán)包括 高溫變性、低溫退火和中溫延伸 反應(yīng) 。待擴(kuò)增 DNA片段經(jīng)高溫變性成為單鏈后，在低溫（如 52℃ ）下與寡聚核苷酸引物退火，然后在中溫下以每一條單鏈為模板，由多聚酶催化延伸引物鏈，分別合成一條新鏈。Localization of RNA 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction， PCR）216。（ 4）組織原位雜交 （ Tissue in situ hybridization）： 指組織或細(xì)胞的原位雜交。在雜交膜上接種轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，裂解以釋放待檢 DNA，變性并固定 DNA，與探針雜交，放射自顯影。 Southern雜交應(yīng)用舉例環(huán)狀芽孢桿菌基因啟動子的分離與鑒定環(huán)狀芽孢桿菌 C2基因啟動子探針與重組 DNA分子的斑點(diǎn)雜交（ 2）斑點(diǎn)雜交 （ Dot blot）：直接將 DNA樣品點(diǎn)在濾膜上使之成為斑點(diǎn)，變性并固定，與探針雜交，放射自顯影。試分析上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雜交膜： 尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜等。3)雜交 :將濾膜與標(biāo)記的 DNA或 RNA探針進(jìn)行雜交。1)電泳 :將已酶切的待檢 DNA樣品