分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-文庫(kù)吧資料
2025-04-10 23:13本頁(yè)面
【正文】 s，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。本實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘后進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增，即94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1 min。試劑（20 μl體系）PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技公司）【操作步驟】 分別在PCR反應(yīng)管中加入2 PCR mix 10 μl、上游和下游引物各2 μl、DNA 2 μl和H2O 4 μl。擴(kuò)增所用的上游引物序列為：5’AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG3’，下游引物序列為：5’GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG3’。由于每次擴(kuò)增的產(chǎn)物又作為下一次擴(kuò)增的模板，因此反應(yīng)產(chǎn)物的量以指數(shù)形式增長(zhǎng)，一個(gè)分子的模板經(jīng)過(guò)n個(gè)循環(huán)可得2n個(gè)分子拷貝產(chǎn)物。當(dāng)溫度升至72℃左右時(shí)，反應(yīng)體系中的DNA聚合酶按照模板鏈的序列以堿基互補(bǔ)方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互補(bǔ)鏈從5 ‘向3’方向不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈。反應(yīng)需要模板、引物、DNA聚合酶和脫氧核糖三磷酸(dNTP)等的參與。反應(yīng)中使用兩條化學(xué)合成的寡核苷酸作為引物，分別與模板DNA兩條單鏈互補(bǔ)，待擴(kuò)增序列片段位于兩條引物之問?！舅伎碱}】 提取和純化的真核組織DNA有何用途？ 你的A260nm/~？有何意義？ 請(qǐng)結(jié)合你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和操作步驟，分析如何檢測(cè)和保證DNA的質(zhì)量？ 實(shí)驗(yàn)二 聚合酶鏈反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增小鼠肝組織平滑肌收縮蛋白（SM22α）基因【實(shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）用于體外擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段（靶序列）。小鼠肝組織中DNA濃度是 μg/ml。當(dāng)然也會(huì)出現(xiàn)DNA溶液中既含蛋白質(zhì)又含RNA，~，所以有必要結(jié)合凝膠電泳等方法鑒定有無(wú)RNA，或用測(cè)定蛋白質(zhì)的方法檢測(cè)是否存在蛋白質(zhì)。（7）A260nm/~，若比值2表示DNA樣品中含有較多的RNA，如比值。據(jù)此來(lái)計(jì)算核酸樣品的濃度。（5）提取過(guò)程應(yīng)盡量保持低溫。（3）酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)避免接觸皮膚。（2）用氯仿除去組織蛋白，要不斷振蕩使蛋白質(zhì)變性。為避免DNA過(guò)度斷裂，不宜用電動(dòng)研磨器制備勻漿。計(jì)算：DNA濃度（μg/ml）= A2605010 （請(qǐng)問系數(shù)50、10是如何得來(lái)的？） DNA純度 = A260nm/A280nm【注意事項(xiàng)】（1）由于DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，為便于提取DNA，肝臟的破碎要嚴(yán)格控制好。（6）加入50 μl Buffer GE溶解DNA（如果DNA的量比較大，可以65℃孵育以促進(jìn)DNA的溶解），室溫保存待測(cè)
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