【正文】 有抑制細胞凋亡的機制，有利于建立持續(xù)感染、延長病毒復制時間、以最大限度產(chǎn)生子代病毒。1）病毒感染引發(fā)細胞凋亡：牛皰疹病毒、雞白血病毒和HIV等，均能通過誘導細胞凋亡而引起宿主細胞缺失。3）除系統(tǒng)性紅斑狼瘡外，還證實類風濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癬均與淋巴細胞凋亡敏感性改變（Fas和FasL突變）有關(guān)。3）.病毒感染與細胞凋亡增加有關(guān)的疾病：1）.AIDS；2）. 神經(jīng)退行性病變，帕金森病，老年癡呆；3）再生性障礙貧血；4）.缺血性損傷，心肌梗塞，腦卒中，再灌注損傷；5）.酒精肝：正常情況下：1） 90%以上的淋巴細胞在胸腺內(nèi)發(fā)育都會發(fā)生凋亡，那些能識別自身抗原的細胞都應被清除，確保被選擇生存下來的淋巴細胞不至于對自身抗原產(chǎn)生免疫應答；2）如果這種選擇性清除失敗，在靶細胞存在下，淋巴細胞被激活，產(chǎn)生大量的效應細胞攻擊靶細胞，導致發(fā)生自身免疫性疾病。主要方法有2種: 1）. TdT介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)； 2）. DNA聚合酶I 或klenow大片段介導的原位的缺口平移(ISNT)。即Bax和Bcl2 比值調(diào)節(jié)凋亡；(4) 當Bclxs存在時，優(yōu)先形成Bclxs/Bcl2 ，使Bax/Bax形式保留，誘導細胞凋亡。10. Bcl2家族對細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制:(1)BclBax和Bclx組成一個凋亡調(diào)控系統(tǒng)。：1）抑制凋亡：bcl2，bclxL，Mcl1 。(3)Bcl2蛋白具抗氧化作用。:(1)屬凋亡抑制基因，阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命，但對細胞周期和分化無影響.(2)阻止或減少各種刺激引起的細胞損傷。突變型P53蛋白：喪失抑制細胞惡性增殖功能，p53基因突變是50%以上腫瘤逃逸凋亡的重要原因。正常狀態(tài)下：胞漿P53水平很低，半衰期很短；胞內(nèi)P53被嚴格監(jiān)控，受HDM2的負反饋調(diào)節(jié)，并通過泛素降解途徑調(diào)節(jié)P53水平。(4)粒酶B介導的細胞凋亡：CrB由CTL分泌進入靶細胞胞漿后,，切割胞漿和核中的多種底物；Caspase依賴的死亡通路是CrB介導細胞死亡的重要途徑之一。(2)線粒體相關(guān)蛋白的凋亡誘導途徑：線粒體跨膜電位(Δψm)的下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔（MPT）破壞或開放，開放的后果是， Δψm 下降、氧化磷化脫偶聯(lián)、GSH耗竭、ROS產(chǎn)生等，并形成惡習性循環(huán)。(3).分類：百余種凋亡調(diào)控因子，正逐漸被組裝成一條條的信息傳導通路，可分為基本傳導通路和非專一性傳導通路二類。:(1).同一性：各種因素引起的凋亡的形態(tài)與生化改變均相同。 CDA游離并進入核內(nèi)降解DNA,）剪切細胞結(jié)構(gòu)蛋白：如Caspase對核板的降解作用。：1）滅活細胞內(nèi)凋亡抑制蛋白：非凋亡細胞中, CDA (caspase活化的DNAase)與其抑制蛋白(ICDA)結(jié)合。：Caspase即天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶。 DNA多態(tài)性的種類：1）DNA位點的多態(tài)性；2）串連重復順序多態(tài)性；3）單核苷酸多態(tài)性二、細胞凋亡1. 細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別:項目 細胞凋亡 細胞壞死誘導因素 生理性、弱刺激性 強烈刺激細胞數(shù)量 單個細胞丟失 成群細胞死亡膜完整性 保持至晚 早期即喪失染色質(zhì) 凝聚呈半月狀 稀疏呈網(wǎng)狀細胞核 早期固縮、斷裂 晚期破碎細胞器 無明顯變化 腫脹、破壞胞內(nèi)容物 無釋放 釋放細胞形狀 形成凋亡小體 破裂成碎片基因組DNA 受調(diào)控降解 隨機降解大分子合成 一般需要 不需要基因調(diào)控 有 無后果 不引起炎癥反應 引起炎癥反應意義 生理性死亡 病理性死亡：1）具有清除個體發(fā)育過程及成熟個體中多余細胞及老化細胞的機體調(diào)節(jié)作用；2）具有消除對機體有害的癌變細胞及病毒感染細胞的機體防御作用。 DNA多態(tài)性標記的價值：1）為路標，構(gòu)建DNA標記的遺傳連鎖圖譜。：、釀酒酵母、黑腹果蠅、秀麗線蟲和小鼠，其序列分析被列為HGP的內(nèi)容；：DNA多態(tài)性:除同卵雙生的兩個體外，沒有兩個人的DNA組成是完全相同的，即人類DNA組成具有多態(tài)性。第三代遺傳標記是SNP（restriction fragment length polymorphism，單核苷酸多態(tài)性），不再是分析長度，而是直接測序2）物理圖:以一段已知序列的DNA片段（STS，sequence tagged site，序列標記位點）并有染色體定位為路標，以Mb或Kb為圖距的基因組圖?！膹垐D：1）遺傳圖:第一代遺傳標記是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性酶切片段多態(tài)性）?？寺』蚨ㄎ环?；原位雜交法；原位PCR；定位克隆技術(shù)。(2).體細胞雜交——初步的基因定位。:(1).家系分析法——發(fā)現(xiàn)感興趣的基因。 3）參與基因的表達調(diào)控. 分類：1）倒位（轉(zhuǎn)）重復順序：指兩互補順序呈反向排列，形成回文結(jié)構(gòu)或發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；2）串連重復順序：由相同的核心順序（2~70bp）成串（頭尾相接）排列而成的高度重復順序。（六 ）功能相關(guān)基因構(gòu)成各種基因家族：1）編碼某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA等。（四） 大量重復序列（repeat sequence）存在。（二）轉(zhuǎn)錄與翻譯不同步，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，功能相關(guān)基因分散排布，無操縱子結(jié)構(gòu)。(5). 基因失活。(3). 序列保守性。分子生物學大題一、基因與基因組:(1).開放閱讀框（open reading frame, ORF）:是始于起始密碼子并終于終止密碼子的一串密碼子。(2). 序列特征——密碼子偏愛和剪接點。(4). 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物:尋找基因的表達產(chǎn)物——RNA或蛋白質(zhì).。:（一）分子量很大的DNA與蛋白質(zhì)形成染色體存在于核內(nèi)。（三） 基因組存在高比例的非編碼序列 (non coding sequence, NCS), NCS可作進化標尺。（五） 基因多為不連續(xù)的，被插入序列（IS）所分隔(這種現(xiàn)象稱為斷裂基因（split gene）. 斷裂基因由內(nèi)含子（intron）（非編碼序列）和外顯子（exon）（編碼序列）交替組成。 2）與染色體構(gòu)象、著絲粒形成有關(guān)。3）散在重復順序。通過分析統(tǒng)計家系中有關(guān)遺傳性狀的連鎖情況和重組率而進行基因定位的方法。(3). 核酸雜交技術(shù)——精確的基因定位。：1)相引是兩個基因位于同一染色體上，相斥則反之；2)同源染色體在減數(shù)分裂時發(fā)生交換；3)位置相近的因子相互連鎖。第二代遺傳標記是STR（short tandem repeat，簡短串連重復序列 ），6000個標記。3）轉(zhuǎn)錄圖又稱表達序列圖或cDNA圖的路標:是以部分5 ’端或3’端cDNA序列（即表達序列標簽，EST）為路標，根據(jù)表達順序的位置和距離作圖4）序列圖：測定總長約30億個核苷酸組成的全染色體序列。如果比較隨機的十個人的常染色體的非編碼區(qū),就會發(fā)現(xiàn)約200~400bp就有一個核苷酸不同,這些可變區(qū)域即稱為DNA多態(tài)性 (DNA polymorphism)位點。2）使遺傳圖譜從直接可見的表型多樣性標記進步到DNA分子本身多態(tài)性標記。細胞凋亡是維持個體生存所必需的一種生物學機制。1）已在哺乳類中發(fā)現(xiàn)14種，分為3個亞類： Caspase1亞家族，Caspase2亞家族，Caspase3亞家族；2）根據(jù)前體分子(procaspase)N端的原結(jié)構(gòu)域(prodomain)分為2類:啟始分子(initiator), 如10等，為蛋白酶級聯(lián)反應的啟始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；效應分子(effector),如7等，作為上游酶的底物被切割活化，再作用于多種蛋白質(zhì)或酶，促使細胞凋亡。凋亡細胞中, caspase剪切ICDA。 在凋亡過程中, caspase在單一位點剪切核纖層蛋白(lamin), 導致核板塌陷, ）剪切效應蛋白: 如參與基因表達蛋白因子,如PARP；4）活化caspase抑制劑。(2).多樣性：環(huán)境因素不同，細胞類型不同，或刺激因素不同時，從凋亡程序啟動到凋亡發(fā)生，其信號傳遞途徑是不同的。:(1)死亡受體介導的細胞凋亡。(3)細胞核凋亡誘導途徑。：自N端起包括：轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、四聚體化區(qū)和C調(diào)節(jié)區(qū)；1）P53的表達與活性調(diào)節(jié)。異常情況下：當細胞DNA損傷、紡錘體絲斷裂、癌基因異常表達等細胞生存面臨威脅時； P53水平迅速升高和活化；2）P53對細胞凋亡和細胞周期的調(diào)節(jié)作用：野生型P53蛋白具維持細胞生長、抑制惡性增殖的作用； P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負責維持基因組的完整性、DNA損傷修復和細胞周期的正常運轉(zhuǎn)；如果損傷不能修復， P53就激活那些誘導凋亡的基因表達，使細胞進入凋亡狀態(tài)。并且本身具有癌基因功能。如Bcl2能阻止由r射線和多種化療藥導致的細胞凋亡。(4)Bcl2蛋白抑制細胞器內(nèi)Ca2+ 離子向胞質(zhì)釋放，而凋亡必須有Ca2+ 離子參與。2）促進凋亡：bax，bclxs ，bad。(2)當Bax/Bax同源二聚體形成時，便誘導細胞凋亡；(3).隨bcl2表達量增加，漸多的Bax/Bax解聚，形成更穩(wěn)定的Bax/Bcl2異源二聚體，從而中和了‘Bax/Bax’誘導凋亡的作用。(in situ end –lableing, ISEL)：原理: ISEL的原理是基于細胞凋亡時，DNA斷裂，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）或DNA聚合酶將帶有生物素標記的核苷酸（biotin16dUTP）摻入到斷裂的DNA的3’端，再使其與帶有辣根過氧化物酶的抗生物蛋白結(jié)合，經(jīng)DAB顯色后，便可觀察到細胞內(nèi)是否存在DNA片段端存在。該法特異性和敏感性較高，可檢出早期的凋亡細胞.：1）.癌癥；2）.自身免疫性疾病，紅斑濃瘡，免疫介導的腎小管腎炎。發(fā)病的分子機制：1）淋巴細胞中調(diào)節(jié)細胞凋亡的一個關(guān)鍵分子是細胞表面受體Fas（又稱APO或CD95）， Fas受體與FasL （配體）結(jié)合即可激活凋亡信號傳導途徑，細胞凋亡；2） T細胞表面受體Fas和FasL發(fā)生突變時，T細胞不能發(fā)生正常凋亡，導致自身免疫性疾病。：病毒的溶解性感染所產(chǎn)生的細胞病變變作用與引發(fā)細胞凋亡有關(guān)；而病毒的持續(xù)性感染與病毒抑制細胞凋亡有關(guān)。如HIV感染后引起CD4+T細胞凋亡而缺失。如EB病毒產(chǎn)生LMP1，使Bcl2基因上調(diào)；牛痘病毒產(chǎn)生crmA,可抑制由caspase所介導的細胞凋亡。1）大多數(shù)腫瘤P53突變、而有些腫瘤過度表達Bcl2蛋白，這些可有效地以避免細胞凋亡發(fā)生。如果損傷不能修復， P53就激活那些誘導凋亡的基因表達，使細胞進入凋亡狀態(tài)。三、細胞周期調(diào)控：：1）間期：G1期 (合成前期)； S期 (DNA合成期)； G2期 (合成后期)。：細胞周期引擎——異二聚體蛋白激酶復合體，包括二個亞單位：1）調(diào)節(jié)亞單位：細胞周期蛋白，其濃度隨細胞周期不斷變化，不僅起激活CDK的作用，還決定了CDK何時、何處、將何種底物磷酸化；2）催化亞單位：細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 (CDK)，單獨存在時無活性，與cyclin結(jié)合才具有蛋白激酶的活性。4）周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI） ：1）細胞周期的啟動（G0→G1）；2)DNA復制（ G0→S ）；3）進入M期 (G2M)； 1）細胞周期的啟動：細胞在生長因子的刺激下，Cyclin D表達，與CDKCDK6結(jié)合而活化激酶224。促進基因的轉(zhuǎn)錄2）DNA復制：CyclinE與CDK2結(jié)合224。CDKCyclin能夠積累224。細胞分裂.、信號傳導通路和效應器構(gòu)成，主要檢驗點有4個：1) G1/S檢驗點: 在哺乳動物中稱R點(restriction point)，控制細胞由靜止狀態(tài)的G1進入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA損傷？細胞外環(huán)境適宜？細胞體積足夠大？2) S期檢驗點：DNA復制是否完成？3) G2/M檢驗點：是決定細胞一分為二的控制點，相關(guān)的事件包括：DNA損傷？細胞體積足夠大？4)中后期檢驗點（紡錘體組裝檢驗點）：任何一個著絲點沒有正確連接到紡錘體上，都會抑制APC的活性，引起細胞周期中斷。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。 2）Bradford檢測法：考馬斯亮藍G250在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應迅速而穩(wěn)。 缺點：對各種純化蛋白質(zhì)反應不同；這種測定方法對蛋白質(zhì)引起不可逆的變性。3）Lowry檢測法：在堿性溶液中形成銅蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸磷鎢酸試劑(Folin酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色的復合物在745 ～750 nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750 nm的光吸收值大小計算蛋白質(zhì)的含量。 注意事項：在加入試劑30 min后呈色達到飽和，時間延長顏色信號減弱；許多干擾物質(zhì)降低顏色反應；高鹽濃度可引起沉淀。 原理：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計算蛋白質(zhì)的含量。2. 經(jīng)典的細胞蛋白質(zhì)分離純化流程由下述主要步驟組成：(1). 清洗組織或細胞。(3). 離心除去膜組分等獲得可溶性蛋白質(zhì)。(5). 獲取產(chǎn)物蛋白。4. 包涵體的形成原因：表達蛋白