細(xì)胞與分子生物學(xué)-文庫吧
2025-03-20 23:49 本頁面
【正文】 與應(yīng)用，取得了許多成就，克隆了一系列的差異表達(dá)基因。這些方法各具獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，但同時也具有其自身不同的缺陷。這些技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)比較已有許多綜述總結(jié)。[5]引物退火時能否與其靶序列特異結(jié)合，是PCR能否成功擴(kuò)增的關(guān)鍵因素之一，因此引物結(jié)構(gòu)的優(yōu)化非常重要。退火溫度的高低決定引物是否能與其互補(bǔ)鏈完全結(jié)合，還是有一個或多個堿基的錯配，因此通過調(diào)整退火溫度就可以增加引物與模板結(jié)合的特異性[6]。許多研究者提出了各種辦法來提高引物退火的特異性，如在引物的5’端增加一段通用引物序列，或加一段同聚物，或加上一段環(huán)狀序列，以增加PCR 擴(kuò)增的特異性和退火的穩(wěn)定性，但這些方法并不能消除初始反應(yīng)的非特異性退火[7]。作者將介紹一種在DDRTPCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對差異表達(dá)基因克隆的新方法，即引物退火控制技術(shù)(Annealling ControlPrimer, ACP）。該方法則可較好地消除初始反應(yīng)的非特異性[8]。 1 ACP技術(shù)的基本原理ACP技術(shù)通過一種特殊引物，使得特異性和靈敏度同時兼顧。具體的引物結(jié)構(gòu)是（圖1）:退火控制引物由獨(dú)特的三部分組成，3＇端和5＇端部分由中間的調(diào)節(jié)部分連接。3＇端部分是核心部分，是一段基因特異性結(jié)合段，能與模板完全互補(bǔ)，但長度較短（10bp）左右，這個長度的核酸退火溫度基本在37℃左右，也就是普通隨機(jī)引物的退火溫度；中間調(diào)節(jié)的部分為多聚脫氧次黃苷[poly(dI)]，一般由5個脫氧次黃苷(dI)組成，在控制引物的退火溫度時起著關(guān)鍵的作用[9]。ACP技術(shù)主要由以下三個部分組成：逆轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈和兩個不同階段的PCR 反應(yīng)；5＇端部分是通用引物序列。這三部分的具體作用為：3＇端的核心序列用于第一、第二輪擴(kuò)增時，保證擴(kuò)增的靈敏度；中間的調(diào)節(jié)部分是ACP技術(shù)實現(xiàn)的關(guān)鍵區(qū)域，作用主要有以下兩方面：①提高核心序列識別模板時的退火溫度，這是由于dI可以識別ATGC任意堿基，這樣就將核心序列的退火溫度提高到50℃左右，②連續(xù)的dI在較低溫度時，形成一個泡狀結(jié)構(gòu)，而使通用引物序列卷曲起來，不參與退火識別，而在較高溫度時形成線性分子，而使整條引物打開，參與退火識別；5＇端的通用調(diào)節(jié)序列是高溫識別的通用引物區(qū)。2 ACP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 假陽性低假陽性高是目前克隆差異表達(dá)基因的瓶頸問題之一， ACP技術(shù)可使引物在初始反應(yīng)與模板鏈特異結(jié)合，擴(kuò)增出真實可靠的產(chǎn)物，從而降低了PCR 結(jié)果的假陽性。[10]只需通過瓊脂糖凝膠電泳就足以進(jìn)行分析ACP技術(shù)顯著提高了PCR 擴(kuò)增的特異性和敏感性，使得PCR產(chǎn)物的特異性大為增強(qiáng)。通過普通脂糖凝膠電泳可以檢測PCR產(chǎn)物，且脂糖凝膠電泳顯示的條帶可以直接用于Northern 雜交分析。[11]ACP 是基于PCR 和普通瓊脂糖電泳的一種技術(shù)，簡單容易操作。 重復(fù)性高由于ACP 采用簡單容易的操作就可得到結(jié)果，避免了繁復(fù)步驟引入誤差的機(jī)會，使得試驗結(jié)果的可重復(fù)性大大提高。[12] 速度快、經(jīng)濟(jì)實惠ACP技術(shù)在較短時間內(nèi)就可克隆到可信的差異表達(dá)基因，且不需要花大量的時間來排除假陽性。 PCR產(chǎn)物分布范圍廣產(chǎn)物條帶分布可為150 bp～2 kb，這樣不僅增加了鑒定差異表達(dá)基因的機(jī)會，也為預(yù)測基因的功能提供了更多重要的序列信息，足以滿足分析所需。[13]3 ACP DDRTPCR技術(shù)的應(yīng)用ACP 技術(shù)在差
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