分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件-文庫(kù)吧
2025-07-21 03:22 本頁(yè)面
【正文】 。2. 溶液II為何必需即用即配？答：NaOH溶液長(zhǎng)時(shí)間配制存放會(huì)與空氣中的CO2反應(yīng)，降低PH值，影響對(duì)細(xì)胞的裂解作用。3. 加入溶液II后作用時(shí)間不能長(zhǎng)，需要快速加入溶液III中和堿性溶液。如果溶液II的作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者反應(yīng)過(guò)于激烈會(huì)導(dǎo)致什么后果？答：作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使細(xì)菌的基因組DNA被打斷，從而不能被徹底沉淀除去，影響質(zhì)粒DNA的純度。4. 在變性蛋白質(zhì)的過(guò)程中，為何必須注意不要將酚殘留在上清液中？答：殘留的酚對(duì)核酸酶具有抑制作用，因而會(huì)影響后面質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)。5. 最后DNA沉淀可以溶解在雙蒸水（ddH2O）中，但最好溶解于TE緩沖液中，為何？答：由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用TrisHCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。\實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)，了解質(zhì)粒DNA電泳條帶的多態(tài)性二、實(shí)驗(yàn)原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下, , 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同,但構(gòu)型不同的DNA分子。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開(kāi)環(huán)DNA(Open circular DNA, 簡(jiǎn)稱 ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快，開(kāi)環(huán)與線狀分子的泳動(dòng)亦有差異，于是在電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生三個(gè)條帶的現(xiàn)象。三、試劑與儀器設(shè)備：1. 質(zhì)粒DNA2. 瓊脂糖3. 6載樣buffer % 二甲苯青FF，% 溴酚藍(lán)，30% 甘油4．50TAE 電泳Buffer Tris， 冰醋酸，10ml mol/L EDTA()，加水至50ml。5．溴化乙錠(EB)溶液 10mg/ml(避光保存)，每100ml瓊脂糖凝膠加5μl貯存液，此試劑為強(qiáng)致癌物，要戴手套操作，避免污染環(huán)境。6. DNA Marker：共6條帶，2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。上樣6ul時(shí)750bp的帶約為100ng，其余帶約為50ng7．各種國(guó)產(chǎn)移液器(10，20，100μl)8．消毒的tips槍頭9．水平電泳槽和電泳儀四、實(shí)驗(yàn)步驟膠液的制備：,置于錐形瓶中,加入50ml 1TAE稀釋緩沖液,放電爐上加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,％瓊脂糖凝膠液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用擋板隔出需要制膠的空間，將膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封擋板內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入1TAE緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。 加樣：取1μl DNA溶液與適量載樣緩沖液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。質(zhì)粒DNA加樣完畢，選取一個(gè)未加樣點(diǎn)樣孔加入6ul DNA Marker。注意每加完一個(gè)樣品要更換tip槍頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2～1cm時(shí),停止電泳。 染色：,室溫下染色2025分鐘。 觀察：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。[注意] EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專(zhuān)門(mén)處理后才能清洗或丟棄。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析質(zhì)粒DNA電泳條帶的形態(tài)。根據(jù)DNA marker分析質(zhì)粒DNA溶液大致的濃度。六、思考題電泳時(shí)所加電壓值如何確定?答：可根據(jù)DNA大小來(lái)確定，越大的電壓可低點(diǎn)，避免拖尾現(xiàn)象；越小的電壓可適當(dāng)大一點(diǎn)縮短電泳時(shí)間，避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)DNA擴(kuò)散導(dǎo)致條帶模糊。就你的理解，DNA marker的用途是什么?答：分析DNA大小和濃度的依據(jù)。電泳中用到兩種buffer，各自的作用。答：上樣緩沖液主要作用： （1）螯合Mg 2＋，防止電泳過(guò)程中DNA被降解，一般上樣緩沖液中含10mmol/l的EDTA。 （2）增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。而在大片段電泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可減少DNA條帶的彎曲和托尾現(xiàn)象。 （3）指示劑監(jiān)測(cè)電泳的行進(jìn)過(guò)程，一般加入泳動(dòng)速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。電泳緩沖液的作用：一是維持合適的pH；二是使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移。 此外，電泳緩沖液還有一個(gè)組分是EDTA，加入濃度為12mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等離子，防止電泳時(shí)激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。 如果質(zhì)粒DNA電泳條帶只有一條，說(shuō)明提取的質(zhì)粒質(zhì)量高還是低，為什么？答：質(zhì)量高。這說(shuō)明產(chǎn)生只有超螺旋的正常質(zhì)粒閉合環(huán)雙鏈DNA。實(shí)驗(yàn)四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法二、 實(shí)驗(yàn)原理 感受態(tài)細(xì)胞的概念 重組DNA分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。 在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。 所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，
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