分子生物學(xué)第五章分子生物學(xué)研究法-文庫吧
2024-12-29 08:02 本頁面
【正文】 ，立即將其轉(zhuǎn)到 42℃ 下做短暫的熱刺激，外源DNA被細(xì)胞所吸收（感受態(tài)）。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo) DNA分子的增殖 523 基因擴(kuò)增 ? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 即 PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA序列的方法。它可以在試管中建立反應(yīng)，經(jīng)數(shù)小時(shí)之后，就能將極微量的目的基因或某一特定 DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬乃至千百萬倍。 PCR技術(shù)的原理 ? 先將雙鏈 DNA分子加熱分離成單鏈，單鏈 DNA模板＋４種 dNTP→ DNA 聚合酶 →新生的 DNA互補(bǔ)鏈。 ? 新合成的 DNA鏈的起點(diǎn)，由加入到反應(yīng)體系中的一對(duì)引物決定的。 PCR反應(yīng)的全過程 ? ＰＣＲ反應(yīng)包括 DNA解鏈 (變性 )、引物與模板 DNA相結(jié)合 (退火 )、 DNA合成 (延伸 )三步，被不斷重復(fù)。 ? 多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈 DNA數(shù)，即兩條引物位點(diǎn)之間的 DNA區(qū)段的拷貝數(shù)， 理論上的最高值是 2n。 ? 待擴(kuò)增 DNA樣品 → 94℃ 1min → 變性 (解鏈 )→ 56℃ 1min → 退火 (引物結(jié)合靶 DNA區(qū)段 ) → 72℃ 1 至數(shù)分鐘 → 延伸，合成新生 DNA互補(bǔ)鏈。 ? 以上循環(huán)在同一個(gè) PCR管中進(jìn)行。反應(yīng)物加完后，溫度由 PCR儀調(diào)整，程序完成后可以拿到產(chǎn)物。 ? 聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction) PCR是 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。 ? 【 開發(fā)史 】 這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明人是 Kary Mullis。 1983年，在一家生物高技術(shù)公司（ Cetus）工作的 Mullis著手解決用簡單的方法鑒定某一段DNA的技術(shù)問題，有一天晚上他驅(qū)車在北部加州 101號(hào)高速公路上，靈機(jī)一動(dòng)想到了一個(gè)實(shí)際上可以無限擴(kuò)增某段 DNA的簡單方法，即 PCR。 在 1985年的一次學(xué)術(shù)會(huì)議上，此方法首次被介紹，在分子生物科學(xué)家中也引起了 鏈 反應(yīng)。大家很快地紛紛采用這個(gè)方法，很多人還很奇怪自己怎么沒有首先想到這么做。 Cetus給了 Mullis一萬美元 的獎(jiǎng)金，隨后把這項(xiàng)技術(shù)的專利以 三億美元 的價(jià)格轉(zhuǎn)讓給另一家生物高技術(shù)公司。在短短的幾年內(nèi)， PCR迅速成為分子生物學(xué)的一項(xiàng)常規(guī)手段，并得到了廣泛的實(shí)際應(yīng)用，被許多科學(xué)家視為近十年分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項(xiàng)技術(shù)突破。 1993年， Mullis因此獲得 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 。 (1)PCR技術(shù)簡史 PCR的最早設(shè)想 ? 核酸研究已有 100多年的歷史，本世紀(jì) 60年代末、 70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)， Korana于 1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想： “ 經(jīng)過 DNA變性，與合適的引物雜交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆 tRNA基因 ” 。 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 解旋酶 解鏈酶 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3’ DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ GGAUCG 5‘ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ AUCGCG 5‘ ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3’ DNA的變性與復(fù)性 變性 復(fù)性 加熱 退火 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA的變性與復(fù)性 變性 復(fù)性 加熱 退火 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA的變性與復(fù)性 變性 復(fù)性 加熱 退火 PCR的實(shí)現(xiàn) ? 耐熱 DNA聚合酶的應(yīng)用使得 PCR能高效率的進(jìn)行 ， 隨后 PECetus公司推出了第一臺(tái) PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀 ? 1993年 ， Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 198
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