分子生物學(xué)第五章分子生物學(xué)研究法(已修改)
2025-01-25 08:02 本頁面
【正文】 第五章 分子生物學(xué)研究方法 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 DNA操作技術(shù) RNA基本操作技術(shù) 核苷酸序列分析 ? 分子生物學(xué) 從 20世紀(jì)中葉開始高速發(fā)展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。 ? 基因操作： DNA的切割和連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析、基因的人工合成、定點(diǎn)突變和 PCR擴(kuò)增。這是分子生物學(xué)研究的 核心技術(shù) 。 ? 基因工程： 在體外將核酸分子插入載體分子中，使之進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。 ? 跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于 毫無親緣關(guān)系 的新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其他技術(shù)的根本特征。 ? 本章將在回顧重組 DNA技術(shù)史上主要事件基礎(chǔ)上，討論 DNA操作技術(shù)、基因克隆的常用載體系統(tǒng)以及基因的分離與鑒定等 3個(gè)環(huán)節(jié) 。 51 重組 DNA技術(shù)史上的重大事件 ? 半個(gè)世紀(jì)以來，分子生物學(xué)研究主要取得了 3大成就 : 第一 解決了 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題 －－ 基因的分子載體是 DNA。 51 重組 DNA技術(shù)史上的重大事件 第二 DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保 留復(fù)制機(jī)制，解決了 基因的自我 復(fù)制和世代交替問題 。 51 重組 DNA技術(shù)史上的重大事件 第三 “ 中心法則 ” 和操縱子學(xué)說，成 功地破譯了遺傳密碼，闡明了 遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。 ? DNA分子體外 切割與連接 技術(shù)及核苷酸 序列分析技術(shù) 的進(jìn)步直接推動(dòng)了重組 DNA技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展。 ? 重組 DNA的核心是用 限制性核酸內(nèi)切酶 和DNA連接酶 對(duì) DNA分子進(jìn)行體外切割和連接。這些酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是現(xiàn)代生物工程技術(shù)史上最重要的事件。 ? 限制性核酸內(nèi)切酶能從特定堿基序列位點(diǎn)切開 DNA。 1972， Boyer實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶 EcoR I能特異識(shí)別 GAAUC序列，將 DNA在這個(gè)位點(diǎn)切開產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。 ? EcoR l酶切產(chǎn)生的任何不同來源的 DNA片段能通過粘性末端之間堿基互補(bǔ)作用而彼此 “ 粘合 ” 起來。 ? 目前為止，科學(xué)家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何 DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電冰技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。 52 DNA基本操作技術(shù) 521 核酸凝膠電泳技術(shù) 1. 基本原理 生物大分子在一定 pH條件下，通常會(huì)帶電荷。將其放置到電場中，就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。 521 核酸的凝膠電泳 1. 基本原理 分子在電場作用下的遷移速度與 電場強(qiáng)度 和電泳分子所帶的凈電荷數(shù)成 正比 ， 與分子的摩擦系數(shù)成 反比 。摩擦系數(shù)是 分子大小 、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)。 521 核酸的凝膠電泳 1. 基本原理 根據(jù)分子大小、構(gòu)型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離。 ? DNA和 RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子 (磷酸基團(tuán) )，在電場中會(huì)向正電極的方向遷移。 ? 在一定的電場強(qiáng)度下， DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的 大小和構(gòu)型 。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離 DNA片段的基本原理。 2. 瓊脂糖凝膠電泳 ? 化學(xué)修飾的低熔點(diǎn)瓊脂糖 (線性多糖聚合物 )，在較低溫度下便會(huì)熔化，冷卻凝固便形成良好的電泳介質(zhì)。常用于 DNA片段的電泳制備。 ? 瓊脂糖凝膠分辨 DNA片段的范圍為 50kb之間 。而聚丙烯酰胺凝膠 (SDS)分辨范圍為 11000bp之間。 ? 凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。 ? 如 20%的 SDS凝膠可分離 16bp的 DNA小片段，而分離 1000bp的 DNA片段則用 3%的SDS凝膠。 ? 再如 2%瓊脂糖凝膠可分離 300bp的雙鏈DNA分子，而分離 大片段 DNA就要用低濃度 (%%)的瓊脂糖凝膠。 ? 脈沖電場凝膠電泳（ PFGE)可分離 50Kb的 DNA小片段 ? 溴化乙錠 (EB)能插入到 DNA或 RNA分子的 相鄰堿基之間 (圖 54)，并在 300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光 , 熒光強(qiáng)度與 DNA片段的數(shù)量成正比 (可檢測到 的 DNA) 。 ? 把 EB直接加到凝膠介質(zhì)中或電泳后染色。 ? 細(xì)菌轉(zhuǎn)化：細(xì)菌菌株由于捕獲了外源 DNA導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。 ? 大腸桿菌是分子生物學(xué)家常用的實(shí)驗(yàn)材料，也是基因工程重要的實(shí)驗(yàn)菌株。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo) DNA分子的增殖 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo) DNA分子的增殖 ? 供體菌株、受體菌株、感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆 ? 細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法 CaCl2法、電擊法（電脈沖）、體外包裝法（噬菌體） ? 大腸桿菌低溫 (0℃) 預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，外源 DNA粘附在細(xì)胞表面
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