分子生物學(xué)第五章分子生物學(xué)研究法-wenkub
2023-01-28 08:02:31 本頁面
【正文】 DNA聚合酶的應(yīng)用使得 PCR能高效率的進(jìn)行 ， 隨后 PECetus公司推出了第一臺 PCR自動化熱循環(huán)儀 ? 1993年 ， Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎 1985年美國 PECetus公司人類遺傳研究室的 Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。 Cetus給了 Mullis一萬美元 的獎金，隨后把這項(xiàng)技術(shù)的專利以 三億美元 的價格轉(zhuǎn)讓給另一家生物高技術(shù)公司。 ? 【 開發(fā)史 】 這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明人是 Kary Mullis。 ? 以上循環(huán)在同一個 PCR管中進(jìn)行。 ? 新合成的 DNA鏈的起點(diǎn)，由加入到反應(yīng)體系中的一對引物決定的。2 ? 細(xì)菌轉(zhuǎn)化：細(xì)菌菌株由于捕獲了外源 DNA導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。 ? 如 20%的 SDS凝膠可分離 16bp的 DNA小片段，而分離 1000bp的 DNA片段則用 3%的SDS凝膠。常用于 DNA片段的電泳制備。 ? DNA和 RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子 (磷酸基團(tuán) )，在電場中會向正電極的方向遷移。摩擦系數(shù)是 分子大小 、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)。將其放置到電場中，就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。 5 ? 限制性核酸內(nèi)切酶能從特定堿基序列位點(diǎn)切開 DNA。1 重組 DNA技術(shù)史上的重大事件 第三 “ 中心法則 ” 和操縱子學(xué)說，成 功地破譯了遺傳密碼，闡明了 遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制。1 重組 DNA技術(shù)史上的重大事件 ? 半個世紀(jì)以來，分子生物學(xué)研究主要取得了 3大成就 : 第一 解決了 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題 －－ 基因的分子載體是 DNA。 ? 基因工程： 在體外將核酸分子插入載體分子中，使之進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。第五章 分子生物學(xué)研究方法 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 DNA操作技術(shù) RNA基本操作技術(shù) 核苷酸序列分析 ? 分子生物學(xué) 從 20世紀(jì)中葉開始高速發(fā)展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。 ? 跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于 毫無親緣關(guān)系 的新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其他技術(shù)的根本特征。 5 ? DNA分子體外 切割與連接 技術(shù)及核苷酸 序列分析技術(shù) 的進(jìn)步直接推動了重組 DNA技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展。 1972， Boyer實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶 EcoR I能特異識別 GAAUC序列，將 DNA在這個位點(diǎn)切開產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。2 DNA基本操作技術(shù) 5 5 5 ? 在一定的電場強(qiáng)度下， DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的 大小和構(gòu)型 。 ? 瓊脂糖凝膠分辨 DNA片段的范圍為 50kb之間 。 ? 再如 2%瓊脂糖凝膠可分離 300bp的雙鏈DNA分子，而分離 大片段 DNA就要用低濃度 (%%)的瓊脂糖凝膠。 ? 大腸桿菌是分子生物學(xué)家常用的實(shí)驗(yàn)材料，也是基因工程重要的實(shí)驗(yàn)菌株。3 基因擴(kuò)增 ? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 即 PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA序列的方法。 PCR反應(yīng)的全過程 ? ＰＣＲ反應(yīng)包括 DNA解鏈 (變性 )、引物與模板 DNA相結(jié)合 (退火 )、 DNA合成 (延伸 )三步，被不斷重復(fù)。反應(yīng)物加完后，溫度由 PCR儀調(diào)整，程序完成后可以拿到產(chǎn)物。 1983年，在一家生物高技術(shù)公司（ Cetus）工作的 Mullis著手解決用簡單的方法鑒定某一段DNA的技術(shù)問題，有一天晚上他驅(qū)車在北部加州 101號高速公路上，靈機(jī)一動想到了一個實(shí)際上可以無限擴(kuò)增某段 DNA的簡單方法，即 PCR。在短短的幾年內(nèi)， PCR迅速成為分子生物學(xué)的一項(xiàng)常規(guī)手段，并得到了廣泛的實(shí)際應(yīng)用，被許多科學(xué)家視為近十年分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項(xiàng)技術(shù)突破。其原理類似于 DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件 摸板 DNA ，寡核苷酸引物， DNA聚合酶，合適的緩沖體系， DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。③大大提高擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加擴(kuò)增長度 ()。 （ 2） PCR技術(shù)的基本原理 ? 假定我們要研究的 DNA雙鏈兩端的序列是 ： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA ? PCR前先人工合成兩段有 2030堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一端配對，把這兩段引物和 DNA模板、 DNA聚合酶、底物（四種脫氧核苷）混合在一起，我們就可以開始做 PCR了。理論上，只要知道任何一段模 板 DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸 鏈做引物，利用 PCR就可將模板 DNA在體外 大量擴(kuò)增。 設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長度 : 1530b
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