揚(yáng)州大學(xué)《現(xiàn)代分子生物學(xué)》 5-分子生物學(xué)研究方法-全文預(yù)覽
【正文】 ig(dt) ,R6 ? 與噬菌體載體分子連接 ? 噬菌體的包裝 常見的 DNA操作技術(shù) 常見的 DNA操作技術(shù) m R N A逆 轉(zhuǎn) 錄 酶c D N A復(fù) 制雙 鏈 cDNA載 體重 組DNA分 子受 體 菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 常見的 DNA操作技術(shù) 文庫中篩選目的基因 DNA探針 ：帶有特殊堿基序列的單鏈 DNA或RNA分子 ,可以用放射性物質(zhì)或免疫性物質(zhì)標(biāo)記 ,通過雜交 ,DNA探針 常用于檢測(cè)互補(bǔ)的堿基序列。 上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，經(jīng) 2530次循 環(huán)后，可將模板 DNA擴(kuò)增達(dá)百萬倍。 常見的 DNA操作技術(shù) 常見的 DNA操作技術(shù) P153 常見的 DNA操作技術(shù) 電擊轉(zhuǎn)化： 使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過 高壓脈沖的作用將載體 DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) ? 能自主復(fù)制 ； ? 具有兩個(gè)以上的 遺傳標(biāo)記 物，便于重組體的篩選和鑒定； ? 有克隆位點(diǎn) （外源 DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； ? 分子量小，以容納較大的外源 DNA。DNA連接酶 ? EcoR I 連接酶 ? T7175。 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 酶類 功能 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開 DNA DNA連接酶 通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè) DNA片段連接成一個(gè)DNA分子 DNA聚合酶 Ⅰ 按 5‘到 3’方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平 DNA雙鏈中的缺口 反轉(zhuǎn)錄酶 按照 RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成 DNA鏈 多核苷酸激酶 把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的 5’ OH末端 末端轉(zhuǎn)移酶 在雙鏈核酸的 3‘末端加上多聚單核苷酸 DNA外切酶 Ⅲ 從 DNA鏈的 3’末端逐個(gè)切除單核苷酸 λ 噬菌體 DNA外切酶 從 DNA鏈的 5’末端逐個(gè)切除單核苷酸 堿性磷酸酯酶 切除位于 DNA鏈 5’或 3’末端的磷酸基團(tuán) DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 限制性核酸內(nèi)切酶 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE) 一類能識(shí)別和切割雙鏈 DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶 分類 : Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ （基因工程技術(shù)中常用 Ⅱ 型） 、 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名 ， 用大寫； 第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個(gè)字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 1972年美國(guó)斯坦福大學(xué) ，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒 DNA。第五章 分子生物學(xué)研究方法 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 DNA操作技術(shù) 基因克隆技術(shù) 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 ? 40年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是 DNA ? 50年代揭示了 DNA 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制，解決了基因的自我復(fù)制和遺傳信息傳遞問題 。 ? 載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立 ? 1970年 ，大腸桿菌的細(xì)胞經(jīng)過氯化鈣適當(dāng)處理之后，便能吸收 λ 噬菌體的 DNA。 ? 基因克隆 (gene cloning) ? 分子克隆 (molecular cloning) DNA技術(shù)的概念 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 重組 DNA技術(shù)的基本步驟 四大要素
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