【正文】 要理化特性，絕對(duì)不能影響其堿基對(duì)特異性。 實(shí)質(zhì)是核酸分子的變性與復(fù)性過(guò)程。：相同點(diǎn)：基本原理。3）人工接頭法：用于在質(zhì)粒和目的基因上沒(méi)有相同的酶切位點(diǎn)。3）缺點(diǎn)：只能合成較小片段的DNA；目的基因DNA序列需通過(guò)氨基酸序列推測(cè)，難于保證與天然基因序列一 致，導(dǎo)致表達(dá)效率大大降低。2）C文庫(kù)構(gòu)建方法：反轉(zhuǎn)錄法合成的cDNA與合適的載體重組并導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成。 2）DNA 3′末端的同位素標(biāo)記。催化平末端連接要比粘性末端 效率低得多。 ②65℃，20min。：① l噬菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌體基因組中央含有30%的DNA是l噬菌體生長(zhǎng)所非必需的。 （二）按受體細(xì)胞分類(lèi)：1）原核細(xì)胞載體：原核克隆型載體，原核表達(dá)型載體； 2）真核細(xì)胞載體（穿梭載體）：真核表達(dá)型載體，真核轉(zhuǎn)遞型載體。(2)有多克隆位點(diǎn)(多種酶單一位點(diǎn))，易于外源DNA分子與載體及重組。若X蛋白能與RNA結(jié)合，則AD靠近報(bào)告基因，使其激活。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。③定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。即靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gal4 P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過(guò)相互作用激活報(bào)告基因的表達(dá)。兩個(gè)融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個(gè)是將Gal4的DNABD與酵母蛋白SNF1融合；另一個(gè)是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。（3）蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達(dá)，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核。④優(yōu)化3AT(3aminotriazole)濃度。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。這種融合蛋白的激活作用被外來(lái)蛋白激活。(6) 在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。(3) 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。(4)廣泛性。(2)真實(shí)性。該載體中可加入進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)型篩選的基因。(3)．酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來(lái)源于哺乳動(dòng)物的蛋白相互結(jié)合：(1)．基因組中GAL4基因是缺失型的。單獨(dú)的AD也不能激活轉(zhuǎn)錄。20. 蛋白質(zhì)的濃縮：1）超濾法；2）冷凍干燥法；3）吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝膠等； 4）沉淀法。6）條帶不整齊：孔徑不均一；膠聚合太快，不均一；可能有氣泡；樣品離子強(qiáng)度過(guò)大。3）多余條帶：還原劑過(guò)量。18. 區(qū)帶電泳的優(yōu)點(diǎn)：1）是帶電的物質(zhì)，都可采用某種電泳技術(shù)，分離成不同位置的區(qū)帶，對(duì)區(qū)帶可進(jìn)行定性或定量分析；2）樣品用量少；3）設(shè)備簡(jiǎn)單；4）可在室溫進(jìn)行；5）操作簡(jiǎn)便，化時(shí)間不多；6）不同類(lèi)型的電泳，有不同的用途；7）改進(jìn)或找到更好的支持介質(zhì)，就有可能大大提高分辨率。：1）假設(shè)有兩種互不混溶的溶劑S和M，將A物質(zhì)溶于一定量的S溶劑中，再加入一定量的M溶劑；2）A物質(zhì)在兩相中相互擴(kuò)散；3）A物質(zhì)在兩相中達(dá)到了平衡(在同一時(shí)間內(nèi)，進(jìn)出兩相的A物質(zhì)的分子數(shù)完全相等)時(shí)，其分配系數(shù)為常數(shù)K=CAS/ CAM。 。 D. 低滲裂解：是指無(wú)胞壁細(xì)胞在低滲溶液中通過(guò)滲透張力作用裂解的方法，常用于紅細(xì)胞的裂解3）化學(xué)法：：有些有機(jī)溶劑(如苯、甲苯等)可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，使內(nèi)含物有選擇性的滲透出來(lái)。2）物理法： A. 超聲法：在處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便、效率高，液量損失少，適于實(shí)驗(yàn)室使用。(4)pH的不連續(xù)性：濃縮膠pH：： 分離膠pH：； 緩沖液pH：。(3)．在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，有三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)。(2)電場(chǎng)強(qiáng)度：指每厘米的電位降，也稱(chēng)電位梯度，或電勢(shì)梯度。：破碎細(xì)胞224。3. 包涵體的成份：包涵體是表達(dá)蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主細(xì)胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和質(zhì)粒編碼蛋白以及LPS。(2). 裂解細(xì)胞。而B(niǎo)CA試劑可敏感特異地與Cu＋結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值。 缺點(diǎn)：干擾物質(zhì)多；反應(yīng)速度慢；某些試劑不穩(wěn)定；使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。藍(lán)色復(fù)合物在595 mn波長(zhǎng)處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測(cè)595 mn的光吸收值大小計(jì)算蛋白的含量。四、蛋白質(zhì)分離純化：1）紫外光譜 (A280)吸收法：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近。SCDK觸發(fā)前復(fù)制復(fù)合體（preRC）啟動(dòng)，同時(shí)阻止DNA再次進(jìn)行復(fù)制.3）進(jìn)入M期 (G2M)：CyclinA、CyclinB與CDK1結(jié)合，形成 MCDK224。參與細(xì)胞周期調(diào)控的分子：1）異二聚體蛋白激酶復(fù)合體；2）生長(zhǎng)因子；3）泛素與APC：泛素由76個(gè)氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞，故名泛素；泛素相當(dāng)于蛋白質(zhì)被摧毀的標(biāo)簽。3）Bcl2屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。：腫瘤不僅是細(xì)胞增殖和分化異常疾病，同時(shí)也是細(xì)胞凋亡異常疾病。1）病毒感染引發(fā)細(xì)胞凋亡：牛皰疹病毒、雞白血病毒和HIV等，均能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而引起宿主細(xì)胞缺失。3）.病毒感染與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)的疾?。?）.AIDS；2）. 神經(jīng)退行性病變，帕金森病，老年癡呆；3）再生性障礙貧血；4）.缺血性損傷，心肌梗塞，腦卒中，再灌注損傷；5）.酒精肝：正常情況下：1） 90%以上的淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育都會(huì)發(fā)生凋亡，那些能識(shí)別自身抗原的細(xì)胞都應(yīng)被清除，確保被選擇生存下來(lái)的淋巴細(xì)胞不至于對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答；2）如果這種選擇性清除失敗，在靶細(xì)胞存在下，淋巴細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量的效應(yīng)細(xì)胞攻擊靶細(xì)胞，導(dǎo)致發(fā)生自身免疫性疾病。即Bax和Bcl2 比值調(diào)節(jié)凋亡；(4) 當(dāng)Bclxs存在時(shí)，優(yōu)先形成Bclxs/Bcl2 ，使Bax/Bax形式保留，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。：1）抑制凋亡：bcl2，bclxL，Mcl1 。:(1)屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，但對(duì)細(xì)胞周期和分化無(wú)影響.(2)阻止或減少各種刺激引起的細(xì)胞損傷。正常狀態(tài)下：胞漿P53水平很低，半衰期很短；胞內(nèi)P53被嚴(yán)格監(jiān)控，受HDM2的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，并通過(guò)泛素降解途徑調(diào)節(jié)P53水平。(2)線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白的凋亡誘導(dǎo)途徑：線(xiàn)粒體跨膜電位(Δψm)的下降，線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPT）破壞或開(kāi)放，開(kāi)放的后果是， Δψm 下降、氧化磷化脫偶聯(lián)、GSH耗竭、ROS產(chǎn)生等，并形成惡習(xí)性循環(huán)。:(1).同一性：各種因素引起的凋亡的形態(tài)與生化改變均相同。：1）滅活細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白：非凋亡細(xì)胞中, CDA (caspase活化的DNAase)與其抑制蛋白(ICDA)結(jié)合。 DNA多態(tài)性的種類(lèi)：1）DNA位點(diǎn)的多態(tài)性；2）串連重復(fù)順序多態(tài)性；3）單核苷酸多態(tài)性二、細(xì)胞凋亡1. 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別:項(xiàng)目 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素 生理性、弱刺激性 強(qiáng)烈刺激細(xì)胞數(shù)量 單個(gè)細(xì)胞丟失 成群細(xì)胞死亡膜完整性 保持至晚 早期即喪失染色質(zhì) 凝聚呈半月?tīng)? 稀疏呈網(wǎng)狀細(xì)胞核 早期固縮、斷裂 晚期破碎細(xì)胞器 無(wú)明顯變化 腫脹、破壞胞內(nèi)容物 無(wú)釋放 釋放細(xì)胞形狀 形成凋亡小體 破裂成碎片基因組DNA 受調(diào)控降解 隨機(jī)降解大分子合成 一般需要 不需要基因調(diào)控 有 無(wú)后果 不引起炎癥反應(yīng) 引起炎癥反應(yīng)意義 生理性死亡 病理性死亡：1）具有清除個(gè)體發(fā)育過(guò)程及成熟個(gè)體中多余細(xì)胞及老化細(xì)胞的機(jī)體調(diào)節(jié)作用；2）具有消除對(duì)機(jī)體有害的癌變細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞的機(jī)體防御作用。：、釀酒酵母、黑腹果蠅、秀麗線(xiàn)蟲(chóng)和小鼠，其序列分析被列為HGP的內(nèi)容；：DNA多態(tài)性:除同卵雙生的兩個(gè)體外，沒(méi)有兩個(gè)人的DNA組成是完全相同的，即人類(lèi)DNA組成具有多態(tài)性?！膹垐D：1）遺傳圖:第一代遺傳標(biāo)記是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性酶切片段多態(tài)性）。(2).體細(xì)胞雜交——初步的基因定位。 3）參與基因的表達(dá)調(diào)控. 分類(lèi)：1）倒位（轉(zhuǎn)）重復(fù)順序：指兩互補(bǔ)順序呈反向排列，形成回文結(jié)構(gòu)或發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；2）串連重復(fù)順序：由相同的核心順序（2~70bp）成串（頭尾相接）排列而成的高度重復(fù)順序。（四） 大量重復(fù)序列（repeat sequence）存在。(5). 基因失活。分子生物學(xué)大題一、基因與基因組:(1).開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORF）:是始于起始密碼子并終于終止密碼子的一串密碼子。(4). 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物:尋找基因的表達(dá)產(chǎn)物——RNA或蛋白質(zhì).。（三） 基因組存在高比例的非編碼序列 (non coding sequence, NCS), NCS可作進(jìn)化標(biāo)尺。 2）與染色體構(gòu)象、著絲粒形成有關(guān)。通過(guò)分析統(tǒng)計(jì)家系中有關(guān)遺傳性狀的連鎖情況和重組率而進(jìn)行基因定位的方法。：1)相引是兩個(gè)基因位于同一染色體上，相斥則反之；2)同源染色體在減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生交換；3)位置相近的因子相互連鎖。3）轉(zhuǎn)錄圖又稱(chēng)表達(dá)序列圖或cDNA圖的路標(biāo):是以部分5 ’端或3’端cDNA序列（即表達(dá)序列標(biāo)簽，EST）為路標(biāo)，根據(jù)表達(dá)順序的位置和距離作圖4）序列圖：測(cè)定總長(zhǎng)約30億個(gè)核苷酸組成的全染色體序列。2）使遺傳圖譜從直接可見(jiàn)的表型多樣性標(biāo)記進(jìn)步到DNA分子本身多態(tài)性標(biāo)記。1）已在哺乳類(lèi)中發(fā)現(xiàn)14種，分為3個(gè)亞類(lèi)： Caspase1亞家族，Caspase2亞家族，Caspase3亞家族；2）根據(jù)前體分子(procaspase)N端的原結(jié)構(gòu)域(prodomain)分為2類(lèi):啟始分子(initiator), 如10等，為蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；效應(yīng)分子(effector),如7等，作為上游酶的底物被切割活化，再作用于多種蛋白質(zhì)或酶，促使細(xì)胞凋亡。 在凋亡過(guò)程中, caspase在單一位點(diǎn)剪切核纖層蛋白(lamin), 導(dǎo)致核板塌陷, ）剪切效應(yīng)蛋白: 如參與基因表達(dá)蛋白因子,如PARP；4）活化caspase抑制劑。:(1)死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。：自N端起包括：轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、四聚體化區(qū)和C調(diào)節(jié)區(qū)；1）P53的表達(dá)與活性調(diào)節(jié)。并且本身具有癌基因功能。(4)Bcl2蛋白抑制細(xì)胞器內(nèi)Ca2+ 離子向胞質(zhì)釋放，而凋亡必須有Ca2+ 離子參與。(2)當(dāng)Bax/Bax同源二聚體形成時(shí)，便誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(3).隨bcl2表達(dá)量增加，漸多的Bax/Bax解聚，形成更穩(wěn)定的Bax/Bcl2異源二聚體，從而中和了‘Bax/Bax’誘導(dǎo)凋亡的作用。該法特異性和敏感性較高，可檢出早期的凋亡細(xì)胞.：1）.癌癥；2）.自身免疫性疾病，紅斑濃瘡，免疫介導(dǎo)的腎小管腎炎。：病毒的溶解性感染所產(chǎn)生的細(xì)胞病變變作用與引發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)；而病毒的持續(xù)性感染與病毒抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。如EB病毒產(chǎn)生LMP1，使Bcl2基因上調(diào)；牛痘病毒產(chǎn)生crmA,可抑制由caspase所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。如果損傷不能修復(fù)， P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡的基因表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。：細(xì)胞周期引擎——異二聚體蛋白激酶復(fù)合體，包括二個(gè)亞單位：1）調(diào)節(jié)亞單位：細(xì)胞周期蛋白，其濃度隨細(xì)胞周期不斷變化，不僅起激活CDK的作用，還決定了CDK何時(shí)、何處、將何種底物磷酸化；2）催化亞單位：細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶 (CDK)，單獨(dú)存在時(shí)無(wú)活性，與cyclin結(jié)合才具有蛋白激酶的活性。促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄2）DNA復(fù)制：CyclinE與CDK2結(jié)合224。細(xì)胞分裂.、信號(hào)傳導(dǎo)通路和效應(yīng)器構(gòu)成，主要檢驗(yàn)點(diǎn)有4個(gè)：1) G1/S檢驗(yàn)點(diǎn): 在哺乳動(dòng)物中稱(chēng)R點(diǎn)(restriction point)，控制細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G1進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA損傷？細(xì)胞外環(huán)境適宜？細(xì)胞體積足夠大？2) S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？3) G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)，相關(guān)的事件包括：DNA損傷？細(xì)胞體積足夠大？4)中后期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）：任何一個(gè)著絲點(diǎn)沒(méi)有正確連接到紡錘體上，都會(huì)抑制APC的活性，引起細(xì)胞周期中斷。 2）Bradford檢測(cè)法：考馬斯亮藍(lán)G250在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。3）Lowry檢測(cè)法：在堿性溶液中形成銅蛋白復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸磷鎢酸試劑(Folin酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745 ～750 nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750 nm的光吸收值大小計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。 原理：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2＋還原成Cu＋。2. 經(jīng)典的細(xì)胞蛋白質(zhì)分離純化流程由下述主要步驟組成：(1). 清洗組織或細(xì)胞。(5). 獲取產(chǎn)物蛋白。：降低細(xì)胞生長(zhǎng)溫度；共表達(dá)分子伴侶；改變滲透壓；融合蛋白： 用變性劑使之成為可溶性的伸展的肽鏈，然后再在適當(dāng)?shù)臈l件下復(fù)性折疊成天然的、有活性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原：(1)帶電顆粒的性質(zhì)：即凈電荷數(shù)量、顆粒大小及形狀。(5)電滲：在電場(chǎng)中，由于多孔支持物吸附水中的正或負(fù)離子使溶液相對(duì)帶電，在電場(chǎng)作用下，溶液就向一定的方向移動(dòng)