【正文】 要理化特性，絕對不能影響其堿基對特異性。 實質(zhì)是核酸分子的變性與復性過程。：相同點：基本原理。3）人工接頭法：用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。3）缺點：只能合成較小片段的DNA；目的基因DNA序列需通過氨基酸序列推測，難于保證與天然基因序列一 致，導致表達效率大大降低。2）C文庫構建方法：反轉(zhuǎn)錄法合成的cDNA與合適的載體重組并導入宿主細胞而形成。 2）DNA 3′末端的同位素標記。催化平末端連接要比粘性末端 效率低得多。 ②65℃，20min。：① l噬菌體生長繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌體基因組中央含有30%的DNA是l噬菌體生長所非必需的。 （二）按受體細胞分類：1）原核細胞載體：原核克隆型載體，原核表達型載體； 2）真核細胞載體（穿梭載體）：真核表達型載體，真核轉(zhuǎn)遞型載體。(2)有多克隆位點(多種酶單一位點)，易于外源DNA分子與載體及重組。若X蛋白能與RNA結合，則AD靠近報告基因，使其激活。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關的小分子物質(zhì)。③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結合蛋白的DNA結合結構域以及準確定位與DNA結合的核苷酸序列。即靶DNA序列特異的結合蛋白(BDPX)與Gal4 P的激活結構域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結合位點之間通過相互作用激活報告基因的表達。兩個融合蛋白分別構建在穿梭質(zhì)粒上，一個是將Gal4的DNABD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。在細胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。（3）蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核。④優(yōu)化3AT(3aminotriazole)濃度。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。(6) 在藥物設計中的應用。(3) 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。(4)廣泛性。(2)真實性。該載體中可加入進行營養(yǎng)型篩選的基因。(3)．酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白相互結合：(1)．基因組中GAL4基因是缺失型的。單獨的AD也不能激活轉(zhuǎn)錄。20. 蛋白質(zhì)的濃縮：1）超濾法；2）冷凍干燥法；3）吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝膠等； 4）沉淀法。6）條帶不整齊：孔徑不均一；膠聚合太快，不均一；可能有氣泡；樣品離子強度過大。3）多余條帶：還原劑過量。18. 區(qū)帶電泳的優(yōu)點：1）是帶電的物質(zhì)，都可采用某種電泳技術，分離成不同位置的區(qū)帶，對區(qū)帶可進行定性或定量分析；2）樣品用量少；3）設備簡單；4）可在室溫進行；5）操作簡便，化時間不多；6）不同類型的電泳，有不同的用途；7）改進或找到更好的支持介質(zhì)，就有可能大大提高分辨率。：1）假設有兩種互不混溶的溶劑S和M，將A物質(zhì)溶于一定量的S溶劑中，再加入一定量的M溶劑；2）A物質(zhì)在兩相中相互擴散；3）A物質(zhì)在兩相中達到了平衡(在同一時間內(nèi)，進出兩相的A物質(zhì)的分子數(shù)完全相等)時，其分配系數(shù)為常數(shù)K=CAS/ CAM。 。 D. 低滲裂解：是指無胞壁細胞在低滲溶液中通過滲透張力作用裂解的方法，常用于紅細胞的裂解3）化學法：：有些有機溶劑(如苯、甲苯等)可以改變細胞壁或膜的通透性，使內(nèi)含物有選擇性的滲透出來。2）物理法： A. 超聲法：在處理少量樣品時操作簡便、效率高，液量損失少，適于實驗室使用。(4)pH的不連續(xù)性：濃縮膠pH：： 分離膠pH：； 緩沖液pH：。(3)．在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，有三種物理效應，即樣品的濃縮效應、分子篩效應及電荷效應。(2)電場強度：指每厘米的電位降，也稱電位梯度，或電勢梯度。：破碎細胞224。3. 包涵體的成份：包涵體是表達蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主細胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和質(zhì)粒編碼蛋白以及LPS。(2). 裂解細胞。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結合，形成穩(wěn)定的有顏色的復合物，在562 nm處有高的光吸收值。 缺點：干擾物質(zhì)多；反應速度慢；某些試劑不穩(wěn)定；使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。藍色復合物在595 mn波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測595 mn的光吸收值大小計算蛋白的含量。四、蛋白質(zhì)分離純化：1）紫外光譜 (A280)吸收法：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近。SCDK觸發(fā)前復制復合體（preRC）啟動，同時阻止DNA再次進行復制.3）進入M期 (G2M)：CyclinA、CyclinB與CDK1結合，形成 MCDK224。參與細胞周期調(diào)控的分子：1）異二聚體蛋白激酶復合體；2）生長因子；3）泛素與APC：泛素由76個氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細胞，故名泛素；泛素相當于蛋白質(zhì)被摧毀的標簽。3）Bcl2屬凋亡抑制基因，阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命。：腫瘤不僅是細胞增殖和分化異常疾病，同時也是細胞凋亡異常疾病。1）病毒感染引發(fā)細胞凋亡：牛皰疹病毒、雞白血病毒和HIV等，均能通過誘導細胞凋亡而引起宿主細胞缺失。3）.病毒感染與細胞凋亡增加有關的疾?。?）.AIDS；2）. 神經(jīng)退行性病變，帕金森病，老年癡呆；3）再生性障礙貧血；4）.缺血性損傷，心肌梗塞，腦卒中，再灌注損傷；5）.酒精肝：正常情況下：1） 90%以上的淋巴細胞在胸腺內(nèi)發(fā)育都會發(fā)生凋亡，那些能識別自身抗原的細胞都應被清除，確保被選擇生存下來的淋巴細胞不至于對自身抗原產(chǎn)生免疫應答；2）如果這種選擇性清除失敗，在靶細胞存在下，淋巴細胞被激活，產(chǎn)生大量的效應細胞攻擊靶細胞，導致發(fā)生自身免疫性疾病。即Bax和Bcl2 比值調(diào)節(jié)凋亡；(4) 當Bclxs存在時，優(yōu)先形成Bclxs/Bcl2 ，使Bax/Bax形式保留，誘導細胞凋亡。：1）抑制凋亡：bcl2，bclxL，Mcl1 。:(1)屬凋亡抑制基因，阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命，但對細胞周期和分化無影響.(2)阻止或減少各種刺激引起的細胞損傷。正常狀態(tài)下：胞漿P53水平很低，半衰期很短；胞內(nèi)P53被嚴格監(jiān)控，受HDM2的負反饋調(diào)節(jié)，并通過泛素降解途徑調(diào)節(jié)P53水平。(2)線粒體相關蛋白的凋亡誘導途徑：線粒體跨膜電位(Δψm)的下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔（MPT）破壞或開放，開放的后果是， Δψm 下降、氧化磷化脫偶聯(lián)、GSH耗竭、ROS產(chǎn)生等，并形成惡習性循環(huán)。:(1).同一性：各種因素引起的凋亡的形態(tài)與生化改變均相同。：1）滅活細胞內(nèi)凋亡抑制蛋白：非凋亡細胞中, CDA (caspase活化的DNAase)與其抑制蛋白(ICDA)結合。 DNA多態(tài)性的種類：1）DNA位點的多態(tài)性；2）串連重復順序多態(tài)性；3）單核苷酸多態(tài)性二、細胞凋亡1. 細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別:項目 細胞凋亡 細胞壞死誘導因素 生理性、弱刺激性 強烈刺激細胞數(shù)量 單個細胞丟失 成群細胞死亡膜完整性 保持至晚 早期即喪失染色質(zhì) 凝聚呈半月狀 稀疏呈網(wǎng)狀細胞核 早期固縮、斷裂 晚期破碎細胞器 無明顯變化 腫脹、破壞胞內(nèi)容物 無釋放 釋放細胞形狀 形成凋亡小體 破裂成碎片基因組DNA 受調(diào)控降解 隨機降解大分子合成 一般需要 不需要基因調(diào)控 有 無后果 不引起炎癥反應 引起炎癥反應意義 生理性死亡 病理性死亡：1）具有清除個體發(fā)育過程及成熟個體中多余細胞及老化細胞的機體調(diào)節(jié)作用；2）具有消除對機體有害的癌變細胞及病毒感染細胞的機體防御作用。：、釀酒酵母、黑腹果蠅、秀麗線蟲和小鼠，其序列分析被列為HGP的內(nèi)容；：DNA多態(tài)性:除同卵雙生的兩個體外，沒有兩個人的DNA組成是完全相同的，即人類DNA組成具有多態(tài)性?！膹垐D：1）遺傳圖:第一代遺傳標記是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性酶切片段多態(tài)性）。(2).體細胞雜交——初步的基因定位。 3）參與基因的表達調(diào)控. 分類：1）倒位（轉(zhuǎn)）重復順序：指兩互補順序呈反向排列，形成回文結構或發(fā)夾狀結構；2）串連重復順序：由相同的核心順序（2~70bp）成串（頭尾相接）排列而成的高度重復順序。（四） 大量重復序列（repeat sequence）存在。(5). 基因失活。分子生物學大題一、基因與基因組:(1).開放閱讀框（open reading frame, ORF）:是始于起始密碼子并終于終止密碼子的一串密碼子。(4). 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物:尋找基因的表達產(chǎn)物——RNA或蛋白質(zhì).。（三） 基因組存在高比例的非編碼序列 (non coding sequence, NCS), NCS可作進化標尺。 2）與染色體構象、著絲粒形成有關。通過分析統(tǒng)計家系中有關遺傳性狀的連鎖情況和重組率而進行基因定位的方法。：1)相引是兩個基因位于同一染色體上，相斥則反之；2)同源染色體在減數(shù)分裂時發(fā)生交換；3)位置相近的因子相互連鎖。3）轉(zhuǎn)錄圖又稱表達序列圖或cDNA圖的路標:是以部分5 ’端或3’端cDNA序列（即表達序列標簽，EST）為路標，根據(jù)表達順序的位置和距離作圖4）序列圖：測定總長約30億個核苷酸組成的全染色體序列。2）使遺傳圖譜從直接可見的表型多樣性標記進步到DNA分子本身多態(tài)性標記。1）已在哺乳類中發(fā)現(xiàn)14種，分為3個亞類： Caspase1亞家族，Caspase2亞家族，Caspase3亞家族；2）根據(jù)前體分子(procaspase)N端的原結構域(prodomain)分為2類:啟始分子(initiator), 如10等，為蛋白酶級聯(lián)反應的啟始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；效應分子(effector),如7等，作為上游酶的底物被切割活化，再作用于多種蛋白質(zhì)或酶，促使細胞凋亡。 在凋亡過程中, caspase在單一位點剪切核纖層蛋白(lamin), 導致核板塌陷, ）剪切效應蛋白: 如參與基因表達蛋白因子,如PARP；4）活化caspase抑制劑。:(1)死亡受體介導的細胞凋亡。：自N端起包括：轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、DNA結合區(qū)、四聚體化區(qū)和C調(diào)節(jié)區(qū)；1）P53的表達與活性調(diào)節(jié)。并且本身具有癌基因功能。(4)Bcl2蛋白抑制細胞器內(nèi)Ca2+ 離子向胞質(zhì)釋放，而凋亡必須有Ca2+ 離子參與。(2)當Bax/Bax同源二聚體形成時，便誘導細胞凋亡；(3).隨bcl2表達量增加，漸多的Bax/Bax解聚，形成更穩(wěn)定的Bax/Bcl2異源二聚體，從而中和了‘Bax/Bax’誘導凋亡的作用。該法特異性和敏感性較高，可檢出早期的凋亡細胞.：1）.癌癥；2）.自身免疫性疾病，紅斑濃瘡，免疫介導的腎小管腎炎。：病毒的溶解性感染所產(chǎn)生的細胞病變變作用與引發(fā)細胞凋亡有關；而病毒的持續(xù)性感染與病毒抑制細胞凋亡有關。如EB病毒產(chǎn)生LMP1，使Bcl2基因上調(diào)；牛痘病毒產(chǎn)生crmA,可抑制由caspase所介導的細胞凋亡。如果損傷不能修復， P53就激活那些誘導凋亡的基因表達，使細胞進入凋亡狀態(tài)。：細胞周期引擎——異二聚體蛋白激酶復合體，包括二個亞單位：1）調(diào)節(jié)亞單位：細胞周期蛋白，其濃度隨細胞周期不斷變化，不僅起激活CDK的作用，還決定了CDK何時、何處、將何種底物磷酸化；2）催化亞單位：細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 (CDK)，單獨存在時無活性，與cyclin結合才具有蛋白激酶的活性。促進基因的轉(zhuǎn)錄2）DNA復制：CyclinE與CDK2結合224。細胞分裂.、信號傳導通路和效應器構成，主要檢驗點有4個：1) G1/S檢驗點: 在哺乳動物中稱R點(restriction point)，控制細胞由靜止狀態(tài)的G1進入DNA合成期，相關的事件包括：DNA損傷？細胞外環(huán)境適宜？細胞體積足夠大？2) S期檢驗點：DNA復制是否完成？3) G2/M檢驗點：是決定細胞一分為二的控制點，相關的事件包括：DNA損傷？細胞體積足夠大？4)中后期檢驗點（紡錘體組裝檢驗點）：任何一個著絲點沒有正確連接到紡錘體上，都會抑制APC的活性，引起細胞周期中斷。 2）Bradford檢測法：考馬斯亮藍G250在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當與蛋白質(zhì)結合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應迅速而穩(wěn)。3）Lowry檢測法：在堿性溶液中形成銅蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸磷鎢酸試劑(Folin酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色的復合物在745 ～750 nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750 nm的光吸收值大小計算蛋白質(zhì)的含量。 原理：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。2. 經(jīng)典的細胞蛋白質(zhì)分離純化流程由下述主要步驟組成：(1). 清洗組織或細胞。(5). 獲取產(chǎn)物蛋白。：降低細胞生長溫度；共表達分子伴侶；改變滲透壓；融合蛋白： 用變性劑使之成為可溶性的伸展的肽鏈，然后再在適當?shù)臈l件下復性折疊成天然的、有活性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構型復原：(1)帶電顆粒的性質(zhì)：即凈電荷數(shù)量、顆粒大小及形狀。(5)電滲：在電場中，由于多孔支持物吸附水中的正或負離子使溶液相對帶電，在電場作用下，溶液就向一定的方向移動