【正文】 多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。CDKCyclin能夠積累224。4）周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI） ：1）細(xì)胞周期的啟動（G0→G1）；2)DNA復(fù)制（ G0→S ）；3）進(jìn)入M期 (G2M)； 1）細(xì)胞周期的啟動：細(xì)胞在生長因子的刺激下，Cyclin D表達(dá)，與CDKCDK6結(jié)合而活化激酶224。三、細(xì)胞周期調(diào)控：：1）間期：G1期 (合成前期)； S期 (DNA合成期)； G2期 (合成后期)。1）大多數(shù)腫瘤P53突變、而有些腫瘤過度表達(dá)Bcl2蛋白，這些可有效地以避免細(xì)胞凋亡發(fā)生。如HIV感染后引起CD4+T細(xì)胞凋亡而缺失。發(fā)病的分子機(jī)制：1）淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個關(guān)鍵分子是細(xì)胞表面受體Fas（又稱APO或CD95）， Fas受體與FasL （配體）結(jié)合即可激活凋亡信號傳導(dǎo)途徑，細(xì)胞凋亡；2） T細(xì)胞表面受體Fas和FasL發(fā)生突變時，T細(xì)胞不能發(fā)生正常凋亡，導(dǎo)致自身免疫性疾病。(in situ end –lableing, ISEL)：原理: ISEL的原理是基于細(xì)胞凋亡時，DNA斷裂，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）或DNA聚合酶將帶有生物素標(biāo)記的核苷酸（biotin16dUTP）摻入到斷裂的DNA的3’端，再使其與帶有辣根過氧化物酶的抗生物蛋白結(jié)合，經(jīng)DAB顯色后，便可觀察到細(xì)胞內(nèi)是否存在DNA片段端存在。2）促進(jìn)凋亡：bax，bclxs ，bad。如Bcl2能阻止由r射線和多種化療藥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。異常情況下：當(dāng)細(xì)胞DNA損傷、紡錘體絲斷裂、癌基因異常表達(dá)等細(xì)胞生存面臨威脅時； P53水平迅速升高和活化；2）P53對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用：野生型P53蛋白具維持細(xì)胞生長、抑制惡性增殖的作用； P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負(fù)責(zé)維持基因組的完整性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)；如果損傷不能修復(fù)， P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡的基因表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。(3)細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)途徑。(2).多樣性：環(huán)境因素不同，細(xì)胞類型不同，或刺激因素不同時，從凋亡程序啟動到凋亡發(fā)生，其信號傳遞途徑是不同的。凋亡細(xì)胞中, caspase剪切ICDA。細(xì)胞凋亡是維持個體生存所必需的一種生物學(xué)機(jī)制。如果比較隨機(jī)的十個人的常染色體的非編碼區(qū),就會發(fā)現(xiàn)約200~400bp就有一個核苷酸不同,這些可變區(qū)域即稱為DNA多態(tài)性 (DNA polymorphism)位點(diǎn)。第二代遺傳標(biāo)記是STR（short tandem repeat，簡短串連重復(fù)序列 ），6000個標(biāo)記。(3). 核酸雜交技術(shù)——精確的基因定位。3）散在重復(fù)順序。（五） 基因多為不連續(xù)的，被插入序列（IS）所分隔(這種現(xiàn)象稱為斷裂基因（split gene）. 斷裂基因由內(nèi)含子（intron）（非編碼序列）和外顯子（exon）（編碼序列）交替組成。:（一）分子量很大的DNA與蛋白質(zhì)形成染色體存在于核內(nèi)。(2). 序列特征——密碼子偏愛和剪接點(diǎn)。(3). 序列保守性。（二）轉(zhuǎn)錄與翻譯不同步，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，功能相關(guān)基因分散排布，無操縱子結(jié)構(gòu)。（六 ）功能相關(guān)基因構(gòu)成各種基因家族：1）編碼某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA等。:(1).家系分析法——發(fā)現(xiàn)感興趣的基因?？寺』蚨ㄎ环?；原位雜交法；原位PCR；定位克隆技術(shù)。第三代遺傳標(biāo)記是SNP（restriction fragment length polymorphism，單核苷酸多態(tài)性），不再是分析長度，而是直接測序2）物理圖:以一段已知序列的DNA片段（STS，sequence tagged site，序列標(biāo)記位點(diǎn)）并有染色體定位為路標(biāo)，以Mb或Kb為圖距的基因組圖。 DNA多態(tài)性標(biāo)記的價值：1）為路標(biāo)，構(gòu)建DNA標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜。：Caspase即天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶。 CDA游離并進(jìn)入核內(nèi)降解DNA,）剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白：如Caspase對核板的降解作用。(3).分類：百余種凋亡調(diào)控因子，正逐漸被組裝成一條條的信息傳導(dǎo)通路，可分為基本傳導(dǎo)通路和非專一性傳導(dǎo)通路二類。(4)粒酶B介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡：CrB由CTL分泌進(jìn)入靶細(xì)胞胞漿后,，切割胞漿和核中的多種底物；Caspase依賴的死亡通路是CrB介導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要途徑之一。突變型P53蛋白：喪失抑制細(xì)胞惡性增殖功能，p53基因突變是50%以上腫瘤逃逸凋亡的重要原因。(3)Bcl2蛋白具抗氧化作用。10. Bcl2家族對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制:(1)BclBax和Bclx組成一個凋亡調(diào)控系統(tǒng)。主要方法有2種: 1）. TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)； 2）. DNA聚合酶I 或klenow大片段介導(dǎo)的原位的缺口平移(ISNT)。3）除系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)猓€證實(shí)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癬均與淋巴細(xì)胞凋亡敏感性改變（Fas和FasL突變）有關(guān)。2）病毒感染抑制細(xì)胞凋亡：許多病毒具有抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制，有利于建立持續(xù)感染、延長病毒復(fù)制時間、以最大限度產(chǎn)生子代病毒。2）P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負(fù)責(zé)維持基因組的完整性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。 2）分裂期：前期；中期；后期；末期。下游蛋白質(zhì)磷酸化224。CDK1使底物蛋白磷酸化224。 注意事項(xiàng)：石英比色杯；調(diào)零所用溶液；配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶液；光密度范圍。 注意事項(xiàng)： ug～15 ug BSA濃度范圍內(nèi)保持線性關(guān)系；反應(yīng)10～15 min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀；若選用目的蛋白來做標(biāo)準(zhǔn)曲線或用另一種方法來校正，所測蛋白濃度較準(zhǔn)確。4）BCA (二喹啉甲酸)檢測法：改進(jìn)的Lowry測定法，反應(yīng)簡單而且?guī)缀鯖]有干擾物質(zhì)的影響。 注意事項(xiàng)：與Lowry相比，采用BCA法時，如果樣品中含有脂類物質(zhì)將明顯提高光吸收值；為促進(jìn)BCA法的反應(yīng)進(jìn)程，可將樣品適當(dāng)加熱。(4). 離心、層析、電泳等進(jìn)一步純化。：除分子伴侶和折疊酶外；還與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)（形成轉(zhuǎn)角的殘基數(shù)目及平均帶電性等）和生長條件（宿主、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基和pH等）有關(guān)。溶解包涵體（用6～8mol/L或 9～10mol/ ～）224。(4)溶液的離子強(qiáng)度：影響電動電位，緩沖液離子強(qiáng) 度越高，電動電位越小，泳動速度慢。：(1)凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠 (stacking gel)； 分離膠 (separating gel)(2)緩沖液離子成分的不連續(xù)性：快離子(前導(dǎo)離子, leading ion)；慢離子(尾隨離子, trailing ion)；緩沖配對離子(緩沖抗衡離子,the buffer counter ion)。由于電泳基質(zhì)的上述四個不連續(xù)性，使樣品在電泳開始時得以濃縮，然后再被分離。 ：由于在此過程中易使活性蛋白失活，故適用于提取非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。 ：必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?：1）利用溶解度的差異分離：。 3）根據(jù)電荷的不同分離：； 。在一定的條件下，一根分配層析柱的理論塔板數(shù)是一定的；2）在分配層析柱中，物質(zhì)只有橫向擴(kuò)散，沒有縱向擴(kuò)散，而且在兩相間達(dá)到分配平衡的速度很快；3）體系中其他物質(zhì)的存在不影響待分離物質(zhì)的分配。 制備：1）原料：丙烯酰胺(Acr)和亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)；2）催化劑：引發(fā)劑（過硫酸銨, (NH4)2S2O8），加速劑（四甲基乙二胺, TEMED；3）化學(xué)聚合和光聚合兩種；4）凝膠濃度和交聯(lián)度；5）不連續(xù)系統(tǒng)制備。 藥品不純。8）條帶彎曲：電泳過程產(chǎn)熱過多；染色、固定時間短。：轉(zhuǎn)錄激活因子上有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。如果X蛋白與Y蛋白之間存在相互作用,那么分別位于這兩個融合蛋白(”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白)上的BD和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活相應(yīng)基因(報告基因)的轉(zhuǎn)錄與表達(dá). 通過對報告基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測,反過來可斷別作為”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用.: (1)．易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。 (3)通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。(1)．高敏感性。(3)簡潔性。p：(1)分析已知蛋白之間的相互作用。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。1）假陽性定義：在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報告基因仍被激活。③AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報告基因；④AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來許多假陽性。目前試劑公司已采用。2）轉(zhuǎn)化效率偏低：辦法：引進(jìn)酵母接合型3）陰性干擾：兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測不出來。雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域。(4)有時DNABD或AD融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，或破壞了融合蛋白的正確折疊。，結(jié)構(gòu)域中的DNABD位于N末端，能識別位于Gal4基因的上游激活序列，AD位于C末端。當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點(diǎn)的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNABD與Gal4的AD靠近, 形成復(fù)合物，激活報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。①確定已知DNA蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在這系統(tǒng)中，野生型BDX/ADY間的相互作用激活一種毒性標(biāo)志作為報告基因，對酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。六、DNA重組\雜交1. DNA重組技術(shù)基本程序：外源DNA的獲取克隆載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的連接 DNA導(dǎo)入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達(dá) ：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩。(4)表達(dá)型載體還應(yīng)有強(qiáng)啟動子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。：1）分子相對較小，具有較高的拷貝數(shù)； 2）含高效的復(fù)制子，可用氯霉素阻止細(xì)菌蛋白 質(zhì)的合成，非使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加；3）具有多種遺傳選擇標(biāo)記，包括各種抗藥基因或營養(yǎng)代謝基因等。(YAC)：1）酵母基因：著絲粒，端粒，自主復(fù)制順序； 2）質(zhì)粒pBR322衍生物：復(fù)制起點(diǎn)(ori)，Ampr基因。用途：1）隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記探針主要用途；2）雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA測序；3）cDNA第二鏈的合成；4）DNA 3′突出末端進(jìn)行末端標(biāo)記(DNA ligase)——基因工程的縫紉針：催化雙鏈DNA相鄰堿基5′P和3′OH間磷酸二酯鍵形成的酶。(TdT)：功能：催化多個脫氧核苷酸依次加到單鏈或雙鏈DNA分子的3′OH末端。 用途：1. 在連接反應(yīng)中去除載體DNA片段5′P，防止載體自我連接. 2. 用32P標(biāo)記5′末端時，用此酶去除5′P，再用激酶進(jìn)行5′的 32P標(biāo)記.：1）基因組文庫(G文庫)用基因克隆的方法保存宿主細(xì)胞中的DNA重組分子中的集合, 所有重組子所含的插入片段的總和代表某種生物基因組全部核苷酸序列； 2）G文庫構(gòu)建方法：鳥槍法； 3）分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù)。：1）使用DNA合成儀。 缺陷：高背景(自身環(huán)化)；雙向(正、反)插入；多拷貝插入。、轉(zhuǎn)染程序：對數(shù)生長期的細(xì)菌――― 感受態(tài)細(xì)菌(4℃保存24h) 37℃，倒置培養(yǎng)重組質(zhì)粒DNA+細(xì)菌熱休克蛋（42度，90秒）普通培養(yǎng)基溫育涂布于含抗生素的培養(yǎng)基平板單菌落20. Southern印跡雜交是將經(jīng)凝膠分離的DNA轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物，再通過特異性探針的雜交來檢測被轉(zhuǎn)移的DNA片段的一種技術(shù)。 Southern印跡雜交：堿變性: 用一已知的DNA或RNA片段(探針)來檢測樣品中未知的核苷酸序列，通過核苷酸間堿基互補(bǔ)的原理互相結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核苷酸序列的位置和大小顯示出來。：1）寡核苷酸探針；2）基因組DNA探針；3）cDNA探針；4）RNA探針。(4).檢測方法具有高度特異性。：優(yōu)點(diǎn)：1）靈敏度極高；2）放射性核素對各種酶促反應(yīng)無任何影響,也不會影響堿基配對的特異性與穩(wěn)定性和雜交性質(zhì)；3）極高的特異性。 非放射性標(biāo)記物：1）生物素；2）地高辛；3）熒光素：FITC，羅丹明。(4)DNA的末端標(biāo)記。′末端標(biāo)記，為加磷酸反應(yīng)，而且要讓p/32P進(jìn)入5′末端，故應(yīng)選擇[γ32P]ATP， 150μci/反應(yīng)。：1）毛細(xì)管轉(zhuǎn)移；2）電轉(zhuǎn)移法；3）真空轉(zhuǎn)移法。(2)．單鏈DNA模板與引物退火 (annealing)：引物與模板形成復(fù)合物的幾率DNA分子自身的復(fù)性。端沒有固定的終止點(diǎn)。 配制時注意:① 由于引物呈很輕的干膜狀附在管壁上,打開時極易散失, 故打開管子前要先離心, 再慢慢打開,溶解時加足量水后蓋蓋,充分上下振蕩5～10min② 溶解后分裝, 凍存于20℃；2） PCR反應(yīng)緩沖液：TrisCl（pH ～)； KCl或(NH4)2SO4:促使引物退火； MgCl2:影響酶活與精確度,產(chǎn)物的特異性； 明膠或BSA或Tween20:穩(wěn)定酶活性； 甲酰胺:使引物與模板特異性配對；3）耐熱DNA聚合酶；4）dNTP：常用濃度是20～200μmol/L；避免反復(fù)凍融, 分裝凍存于20℃；5）模板DNA：抽提方法：簡單的水煮沸法，去垢劑裂解細(xì)胞→蛋白酶消化蛋白→有機(jī)溶劑抽提→乙醇沉淀核酸。端不能有任何修飾, 3 39。端不要終止于密碼子的第3位。底物dNTP濃度；4。:1)病毒感染。2）. 附加物的選取: 附加物有表位標(biāo)簽{如(His)GST}、GFP等。：①整合型質(zhì)粒； ②附加體質(zhì)粒； ③復(fù)制型質(zhì)粒； ④著絲粒質(zhì)粒； ⑤酵母人工染色體：（一）、酵母細(xì)胞表達(dá)載體； （二）、酵母細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)：1）酵母細(xì)胞培養(yǎng)； 細(xì)胞密度測定； 酵母細(xì)胞株的保存；2）酵母質(zhì)粒的提?。?）外源基因?qū)虢湍讣?xì)胞。1）1. 桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體結(jié)構(gòu)：多數(shù)載體由pUC質(zhì)粒改造而來，含ampr基因。C：選用BACToBACR Baculovirus Expression System：先通過將目的基因克隆到供體質(zhì)粒pFastBac1上并轉(zhuǎn)化入含助手質(zhì)粒和桿狀病毒穿梭載體的感受態(tài)大腸桿菌