【正文】 。 ?農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心 (太原 )作為全國(guó)玉米種子電泳測(cè)純技術(shù)項(xiàng)目協(xié)作攻關(guān)單位之一，已廣泛開(kāi)展了玉米、小麥種子純度電泳檢測(cè)工作，年檢測(cè)樣品量約 300份，為政府和企業(yè)決策提供了充分的依據(jù)。 ?1986年 ISTA正式頒布了“醇溶蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）鑒定品種的程序”并列入 《 1993國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程 》 ，我國(guó)也將其納入 GB/T35431995《 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 》 。 ?等電聚焦電泳技術(shù)出現(xiàn)后，因其譜帶清晰、分辨率高而備受歡迎，但由于其成本高、時(shí)間長(zhǎng)、技術(shù)難度大，難以推廣等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了它在種子測(cè)純中的應(yīng)用。 ?種子電泳技術(shù)是通過(guò)蛋白質(zhì)或同工酶的分子大小和電荷數(shù)量或兩項(xiàng)同時(shí)具有的差異進(jìn)行分離，并形成不同電泳圖譜而顯示種和品種之間差異的有效方法。 ? 用于標(biāo)記的熒光基團(tuán)在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似 ,分子量也基本相同 ,都帶有正電荷 ,所以在與賴氨酸殘基反應(yīng)時(shí) ,保證了所有的樣品可以移至相同的位置。 差異凝膠電泳 ? 將樣品在電泳前標(biāo)記 Cy Cy3 和 Cy5 這 3 種熒光染料 ,然后將標(biāo)記后的 3 種樣品混合 , 同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行電泳 ,即為差異凝膠電泳 (DIGE) 。 如 2：做中樞神經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)是不能直接觀察的，所以通常都是把記錄電極和吸量管連結(jié)起來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 ?此法和微電極記錄法結(jié)合起來(lái)，在研究諸如化學(xué)遞質(zhì)和各種物質(zhì)的作用方面是非常有效的。在尖端極細(xì)（數(shù)微米以下）的小玻璃吸量管中加上藥液，當(dāng)給吸量管通電時(shí)，藥物離子和中性分子便分別通過(guò)電泳和電滲透向吸量管尖端移動(dòng)而被釋放出來(lái)。 ?ξ電位常因細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在診斷疾病上有一定價(jià)值。尚可用來(lái)分離不同種類(lèi)的細(xì)胞，例如可把淋巴樣細(xì)胞與造血細(xì)胞分開(kāi)。引起細(xì)胞電泳的電位值稱為 ξ電位。因此沒(méi)有抗原性的物質(zhì)或抗原性差的物質(zhì)、非沉淀反應(yīng)性抗體，均不能用免疫電泳進(jìn)行分析。 2．抗血清雖然含有對(duì)所有抗原物質(zhì)的相應(yīng)抗體，但抗體效價(jià)有高有低，因此要適當(dāng)考慮抗原孔徑的大小和抗體槽的距離。 注意事項(xiàng) 1．免疫電泳分析法的成功與否，主要取決于抗血清的質(zhì)量。 4．沉淀弧的位置 ?高分子量的物質(zhì)擴(kuò)散慢，所形成的沉淀線離抗原孔較近； ?分子量較小的物質(zhì)，擴(kuò)散速度快，沉淀弧離抗體槽近一些。馬抗血清所形成的沉淀線致密、清晰，抗原或抗體過(guò)量時(shí)，復(fù)合物沉淀溶解、消失，而且產(chǎn)生繼發(fā)性的非特異性沉淀。 ?抗血清多來(lái)源于兔、羊、馬。 ?有較寬遷移范圍的物質(zhì)，其沉淀弧曲度較小。 免疫電泳結(jié)果分析 1．常見(jiàn)的沉淀弧 ? 由于經(jīng)電泳已分離的各抗原成分在瓊脂中呈放射狀擴(kuò)散，而相應(yīng)的抗體呈直線擴(kuò)散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，常見(jiàn)的弧形如下： ? ①交叉弧：表示兩個(gè)抗原成分的遷移率相近，但抗原性不同；②平行?。罕硎緝蓚€(gè)不同的抗原成分，它們的遷移率相同，但擴(kuò)散率不同；③加寬?。阂话闶怯捎诳乖^(guò)量所致；④分枝?。阂话闶怯捎诳贵w過(guò)量；⑤沉淀線中間逐漸加寬并接近抗體槽，一般由于抗原過(guò)量，在白蛋白位置處形成；⑥其它還有彎曲弧、平坦弧、半弧等。 酶標(biāo)對(duì)流免疫電泳 ?利用酶標(biāo)記抗原（抗體）和待測(cè)抗體（抗原）在電場(chǎng)中向一定方向移動(dòng)，在比例適當(dāng)?shù)牡胤叫纬沙恋砭€，通過(guò)酶作用底物而顯色，指示沉淀線的存在。 放射免疫對(duì)流電泳 ?將放射性元素標(biāo)記的抗體（或抗原）與相應(yīng)的抗原（或抗體）沉淀時(shí)，沉淀線通過(guò)自顯影而證實(shí)。將未結(jié)合的游離抗原或抗體洗去，則出現(xiàn)被結(jié)合固定的某種蛋白?？捎糜诟鞣N蛋白質(zhì)的鑒定。放射免疫自顯影技術(shù)可測(cè)出 ng/ml的抗原濃度。加入少量 125I標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見(jiàn)的放射自顯影技術(shù)。為了糾正這種現(xiàn)象，可用甲醛與 IgG上的氨基結(jié)合（甲?；?，使本來(lái)帶兩性電荷的 IgG變?yōu)橹粠щ姾桑涌炝穗娪舅俣?，抵消了電滲作用，而出現(xiàn)伸向陽(yáng)極的火箭峰。否則易形成寬底峰形，使定量不準(zhǔn)。 2．注意電泳終點(diǎn)時(shí)間，如火箭電泳頂部呈不清晰的云霧狀或圓形皆提示未達(dá)終點(diǎn)。 ?抗體濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標(biāo)本中的抗原含量。 火箭電泳圖 ①②③為標(biāo)本；④⑤⑥為標(biāo)準(zhǔn)抗原 ?抗原泳向陽(yáng)極，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。 火箭免疫電泳 ?又稱單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。 ?其基本原理是：在瓊脂板上打兩排孔，左側(cè)各孔加入待測(cè)抗原，右側(cè)孔內(nèi)放入相應(yīng)抗體，抗原在陰極側(cè)，抗體在陽(yáng)極側(cè)。 ?免疫電泳目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識(shí)別等方面。 免疫電泳擴(kuò)散模式圖 白蛋白 A1b；球蛋白 α1區(qū)、 α2區(qū)、 β區(qū)和 γ區(qū) ALB α1 α2 β γ 白蛋白 α1抗胰蛋白酶 觸珠蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白 IgG 前白蛋白 α1酸糖蛋白 銅藍(lán)蛋白 C3a、 C3b CRP α1脂蛋白 抗糜蛋白酶 2巨球蛋白 IgA、 IgM、 IgD、纖維蛋白原、 β1脂蛋白、血凝素 血漿免疫電泳各區(qū)帶所含蛋白成分 血漿蛋白各區(qū)帶位置示意圖 PreALB：前白蛋白； HP：觸珠蛋白； α1脂蛋白； ALB：白蛋白； TRF：轉(zhuǎn)鐵蛋白 βLIP： β脂蛋白； AAT：抗胰蛋白酶； AAG：酸糖蛋白；α2M： α2巨球蛋白 ?免疫電泳沉淀線的數(shù)目和分辨率受許多因素影響： ? 首先是抗原與抗體的比例，同其它沉淀反應(yīng)一樣，要預(yù)測(cè)抗體與抗原的最適比； ? 其次是抗血清的抗體譜，一只動(dòng)物的抗血清往往缺乏某些抗體，如將幾只動(dòng)物或幾種動(dòng)物的抗血清混合使用，則效果更好； ? 電泳條件，如緩沖液、瓊脂和電泳等皆可直接影響沉淀線的分辨率。 ?免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。此法是由格拉巴（ P． Grabar）和威廉斯（ C． A． Williams Jr．，1953）所開(kāi)創(chuàng)，主要用于分析血清蛋白的組成。此法有發(fā)展前景。 5. 毛細(xì)管等速電泳 (capillary isotachorphoresis,CITP) ?是一種較早的模式，采用先導(dǎo)電解質(zhì)和后繼電解質(zhì)，使溶質(zhì)按其電泳淌度不同得以分離，常用于分離離子型物質(zhì)，目前應(yīng)用不多。 ?加高壓 (6～ 8kV)3～ 5min后 , 毛細(xì)管內(nèi)部建立 pH梯度 ,蛋白質(zhì)在毛細(xì)管中向各自等電點(diǎn)聚焦 , 形成明顯的區(qū)帶。 4. 毛細(xì)管等電聚焦 (capillary isoelectric focusing, CIEF) ?將普通等電聚焦電泳轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行。它能避免空泡形成 , 比凝膠柱制備簡(jiǎn)單 ,壽命長(zhǎng) , 但分離能力比凝膠柱略差。 ? 常用聚丙烯酰胺在毛細(xì)管內(nèi)交聯(lián)制成凝膠柱 , 可分離、測(cè)定蛋白質(zhì)和 DNA的分子量或堿基數(shù) , 但其制備麻煩 , 使用壽命短。 ? 凝膠具有多孔性 ,起類(lèi)似分子篩的作用 , 溶質(zhì)按分子大小逐一分離。 ? MECC使 CE能用于中性物質(zhì)的分離 , 拓寬了 CE的應(yīng)用范圍 , 是對(duì) CE極大的貢獻(xiàn)。 ? 雖然膠束帶負(fù)電 , 但一般情況下電滲流的速度仍大于膠束的遷移速度 , 故膠束將以較低速度向陰極移動(dòng)。前述基本原理即是 CZE的基本原理?，F(xiàn)在有的采用液體冷卻方式的毛細(xì)管電泳儀可使用離子強(qiáng)度高達(dá) 進(jìn)行分離 , 或使用 200 直徑的毛細(xì)管進(jìn)行微量制備 , 仍能達(dá)到良好的分離效果和重現(xiàn)性。因此 , 加快散熱是減小自熱引起的溫差的重要途徑。高離子強(qiáng)度緩沖液可阻止蛋白質(zhì)吸附于管壁 , 并可產(chǎn)生柱上濃度聚焦效應(yīng) , 防止峰擴(kuò)張 , 改善峰形。 ? 此外 , 溫度改變使溶液 pH值、粘度等發(fā)生變化 , 進(jìn)一步導(dǎo)致電滲流、溶質(zhì)分子的電荷分布 (包括蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) )、離子強(qiáng)度等的改變 , 造成淌度改變、重復(fù)性變差、柱效下降等現(xiàn)象。 ? 溶液粘度隨溫度升高呈指數(shù)下降 , 溫度梯度使介質(zhì)粘度在徑向產(chǎn)生梯度 , 從而影響溶質(zhì)遷移速度 , 使管軸中心的溶質(zhì)分子要比近管壁的分子遷移得更快 , 造成譜帶展寬 , 柱效下降。但高場(chǎng)強(qiáng)導(dǎo)致電流增加 , 引起毛細(xì)管中電解質(zhì)產(chǎn)生焦耳熱 (自熱 )。 ?按檢測(cè)方式可分為固定波長(zhǎng)或可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和二極管陣列或波長(zhǎng)掃描檢測(cè)器兩類(lèi)。它使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細(xì)管內(nèi)原則上不會(huì)擴(kuò)張。 ?迄今為止 , 除了原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜 (ICP)及紅外光譜未用于 CE外 , 其它檢測(cè)手段如：紫外、熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜、激光等類(lèi)型檢測(cè)器均已用于 CE。 ?實(shí)際測(cè)試電滲淌度時(shí)可用中性組分，此時(shí) μep=0, μeo=μapp, μeo =μ/E = （ Ld /t） /（ V /Lt） 毛細(xì)管電泳基本裝置 ?CE只需高壓直流電源、進(jìn)樣裝置、毛細(xì)管和檢測(cè)器。此時(shí)必須改變電場(chǎng)方向，方可檢測(cè)到欲分析的離子。 ?CE 中觀察到的離子速度是離子的電泳淌度μeo和溶液的電滲淌度 μep的加和。 淌度：溶質(zhì)在單位時(shí)間內(nèi)、單位電場(chǎng)上移動(dòng)的距離 ?影響電滲的一個(gè)重要因素是毛細(xì)管中因電流作用產(chǎn)生的焦耳熱，能使得柱中心的溫度高于邊緣的溫度，形成拋物線型的溫度梯度，管壁附近溫度低，中心溫度高，結(jié)果使電滲淌度不均勻而造成區(qū)帶變寬，柱效降低。 ?在低 pH條件下，硅氧層形成分子 （ SiOH），因而減少了表面電荷密度，故電滲速度減小。 ?電滲流的速度 ueo和電場(chǎng)強(qiáng)度 E成正比，定義電滲淌度 μeo。在熔融石英毛細(xì)管內(nèi)壁覆蓋一層硅氧基（ SiO）陰離子，由于吸引了溶液中的陽(yáng)離子，由此在毛細(xì)管內(nèi)壁形成表面帶陰離子的雙電層。有些理論研究和實(shí)際應(yīng)用正在進(jìn)行與開(kāi)發(fā)。 ? CE的優(yōu)點(diǎn)可概括為三高二少： ? 高靈敏度 , 常用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá) 1013～ 1015mol，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器則達(dá) 1019～ 1021mol； ? 高分辨率 , 其每米理論塔板數(shù)為幾十萬(wàn)；高者可達(dá)幾百萬(wàn)乃至千萬(wàn) , 而 HPLC一般為幾千到幾萬(wàn)； ? 高速度 , 最快可在 60s內(nèi)完成 , 在 250s內(nèi)分離 10種蛋白質(zhì) , 19種陽(yáng)離子 , 3min內(nèi)分離 30種陰離子； ? 樣品少 , 只需 nL (109 L)級(jí)的進(jìn)樣量； ? 成本低 , 只需少量 (幾毫升 )流動(dòng)相和價(jià)格低廉的毛細(xì)管。 是