生物分離工程第八章電泳技術(shù)(參考版)
2025-01-19 11:54本頁面
【正文】 雙相電泳 ?第一相 等電聚焦 ?第二相 SDS－ PAGE 目的：為了獲得更詳細(xì)的組分信息 目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組研究中 本章作業(yè) ? 電泳的基本原理 ? 電泳技術(shù)的分類 ? 常用的凝膠電泳技術(shù)有哪些？ ? 聚丙稀酰胺凝膠電泳與 SDSPAGE的異同 ? 瓊脂糖電泳的特點(diǎn)及其應(yīng)用 ? 等電聚焦電泳的基本原理 ? 雙相電泳的概念及其特點(diǎn) 。依次類推，所有的載體兩性電解質(zhì)分子用增加 pI級數(shù)的方法將分別在陽極、陰極之間到達(dá)它們自己的位置，從而給出一個 pH梯度。 ?其次， 一些低 pI的載體兩性電解質(zhì)（荷其次多的負(fù)電）也向陽極移動，直到它的凈電荷減少到 0才停止。 用于等電聚焦的主要載體兩性電解質(zhì) ? Ampholine(瑞典 LKB公司 ) – 由許多脂肪族的多氨基多羧基的異構(gòu)體和同系物組成，它們具有連續(xù)改變的氨基與羧基比 ? Servalyte (德國 Serva 公司 ) – 產(chǎn)品 Biolyte ? Pharmalyte (瑞典 Pharmacia 公司 ) – 產(chǎn)品分為九種 pH范圍 pH梯度的形成 ?在沒有電場時，載體兩性電解質(zhì)的 pH值大約是該溶液 pH范圍的平均值 ，所有載體兩性電解質(zhì)分子都荷電。 ?可以 利用等電點(diǎn)差異來進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離、分析 載體兩性電解質(zhì) pH梯度等電聚焦原理 ?載體兩性電解質(zhì) pH梯度等電聚焦是在支持介質(zhì)中加入 載體兩性電解質(zhì) ，通以直流電后在兩極之間 形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的 pH梯度 ，當(dāng)帶電的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入該體系時，便會產(chǎn)生移動，并 聚集于相當(dāng)于其等電點(diǎn)的位置 。 工作原理 ?蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)最主要的特性是它的帶電行為，它們在不同的 pH環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負(fù)電，只是在某一 pH時，蛋白質(zhì)的凈電荷為 0，此 pH即為該蛋白的等電點(diǎn)（ isoelectric point pI）。 ?利用等電聚焦技術(shù)分離、分析的對象僅限于蛋白質(zhì)和兩性分子。 – 因此，在樣品和凝膠中加入 SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與 SDS結(jié)合后，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì) SDS膠束， 所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異 ；同時， 蛋白質(zhì) SDS聚合體的形狀也基本相同 ，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。 ? 根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為： – 非排阻性凝膠（ unrestrictive gel） :濃度 ~%的瓊脂糖凝膠； – 排阻性凝膠（ restrictive gel） ：濃度大于 1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī) PAGE ? 凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠，樣品仍留在加樣位置； ? 凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖液推進(jìn)，不能得到很好的分離； 凝膠濃度 (C=%) 分子量范
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