【正文】 第八章 電泳技術(shù) 第八章 電泳技術(shù) 第一節(jié) 電泳技術(shù)發(fā)展簡史 第二節(jié) 電泳的基本原理 第三節(jié) 影晌電泳分離的主要因素 第四節(jié) 電泳的分類 第五節(jié) 各種電泳技術(shù)介紹 第六節(jié) 電泳測純技術(shù) 第一節(jié) 電泳技術(shù)發(fā)展簡史 ?1809年，俄國物理學(xué)家 Рейсе首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負(fù)兩個(gè)電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負(fù)電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現(xiàn)象。 ?1909年， Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同 pH的溶液在 U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點(diǎn)。 ?1937年，瑞典 Uppsala大學(xué)的 Tiselius對電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了 Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及 α、 β、 γ球蛋白組成的，由于 Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開拓性貢獻(xiàn)而獲得了 1948年的諾貝爾化學(xué)獎。 ?1948年， Wieland和 Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對氨基酸的分離進(jìn)行了研究。 ?上世紀(jì) 50年代起，特別是 1950年， Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。 ?1959年， Raymond和 Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。 ?聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術(shù)，是檢驗(yàn)生化物質(zhì)的最高純度：即“電泳純”（一維電泳一條帶或二維電泳一個(gè)點(diǎn)）的標(biāo)準(zhǔn)分析鑒定方法，至今仍被人們稱為是對生物大分子進(jìn)行分析鑒定的最后、最準(zhǔn)確的手段，即“ Last Check”。 ?上個(gè)世紀(jì) 80年代發(fā)展起來的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。 第二節(jié) 電泳的基本原理 ?電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。 ?許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們在某個(gè)特定的 pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。 ?電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。 ?電泳過程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。 ?Tiselius等在 1937年進(jìn)行的自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì)，所以擴(kuò)散和對流都比較強(qiáng)，影響分離效果。 ?樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過程，減少了擴(kuò)散和對流等干擾作用。 ?支持介質(zhì)：濾紙、醋酸纖維素膜、硅膠薄層平板、淀粉凝膠、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等。 ?電泳裝置主要包括兩個(gè)部分：電源和電泳槽。 ?電源提供直流電，在電泳槽中產(chǎn)生電場，驅(qū)動帶電分子的遷移。 ?電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。 ?垂直板式電泳是較為常見的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。 ?稀溶液中，電場對帶電分子的作用力（ F）等于分子所帶凈電荷量（ q）與電場強(qiáng)度（ E）的乘積。即： F＝ qE ?帶電分子移動過程中，會受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力（ Fˊ）的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)，并與帶電分子的移動速度成正比，對于球狀分子， Fˊ的大小服從 Stoke定律，即：Fˊ=6πrηυ ?r是球狀分子的半徑， η是緩沖液粘度（或介質(zhì)粘滯系數(shù)）， υ是電泳速度 (單位： cm/s )。 ?當(dāng)帶電分子勻速移動時(shí)： F = F’ ∴ qE = 6πrηυ υ=qE/6πrη ?電泳遷移率（ m）：單位電場強(qiáng)度下的遷移速度： m = υ/E = q/6πrη ?電泳遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。 ?帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開。 ?即使兩個(gè)分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過程中就可以被分離。 ?有些類型的電泳幾乎完全依賴于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離，如等電聚焦電泳； ?有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離，如 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 第三節(jié) 影晌電泳分離的主要因素 待分離生物大分子的性質(zhì) 緩沖液的性質(zhì) 電場強(qiáng)度 電滲 支持介質(zhì)的篩孔 待分離生物大分子的性質(zhì) ?待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質(zhì)都會對電泳有明顯影響。 ?一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。 緩沖液的性質(zhì) ?主要是指電極溶液（緩沖溶液）和蛋白質(zhì)樣品溶液的 pH值、離子強(qiáng)度和粘度等。 pH值 ?溶液 pH值決定帶電顆粒的解離程度，也即決定其帶凈電荷的量。 ?對兩性電解質(zhì)（如蛋白質(zhì)）而言，溶液的 pH值離其等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，帶凈電荷量就越多，泳動速度就越快。 ?緩沖液 pH還會影響到其電泳方向，當(dāng)緩沖液 pH大于兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)，兩性電解質(zhì)帶負(fù)電荷，其電泳的方向是指向正極。 ?電泳時(shí)應(yīng)選擇適宜的 pH值，并需采用緩沖溶液，使溶液的 pH值恒定。 離子強(qiáng)度 ?為了保持電泳過程中待分離生物大分子的電荷以及緩沖液 pH值的穩(wěn)定性，緩沖液通常要保持一定的離子強(qiáng)度，一般在 － 。 ?離子強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，往往會因溶液 pH值變化而影響泳動的速率。 ?離子強(qiáng)度過高，會在待分離分子周圍形成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），由于離子氛與待分離分子的移動方向相反，它們之間產(chǎn)生了靜電引力，因而引起電泳速度降低。 ?離子強(qiáng)度的計(jì)算公式為： I＝ 1/2∑mizi2=1/2(m1z12+m2z22+…m nzn2) ?I：溶液的離子強(qiáng)度； mi：離子的摩爾濃度； zi：離子的價(jià)數(shù)； 1， 2， …n 代表各種離子。 溶液粘度 ?泳動度與溶液粘度是成反比關(guān)系。粘度過大或過小，必然影響泳動度。 電場強(qiáng)度 ?電場強(qiáng)度（ V/cm）是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場強(qiáng)度越大，電泳速度越快。但增大電場強(qiáng)度會引起通過介質(zhì)的電流強(qiáng)度增大，而造成電泳過程產(chǎn)生的熱量增大。電流在介質(zhì)中所做的功（ W）為： W=I2Rt ?I為電流強(qiáng)度， R為電阻， t為電泳時(shí)間。 ?電流所作的功絕大部分都轉(zhuǎn)換為熱，因而引起介質(zhì)溫度升高，這會造成很多影響： ①樣品和緩沖離子擴(kuò)散速度增加，引起樣品分離帶的加寬； ②產(chǎn)生對流，引起待分離物的混合； ③如果樣品對熱敏感，會引起蛋白變性； ④引起介質(zhì)粘度降低、電阻下降等等。 ?電泳中產(chǎn)生的熱通常是由中心向外周散發(fā)的，介質(zhì)中心溫度一般要高于外周，尤其是管狀電泳，由此引起中央部分介質(zhì)相對于外周部分粘度下降，摩擦系數(shù)減小，電泳遷移速度增大，電泳分離帶通常呈弓型。 ?電場強(qiáng)度或電極緩沖液中離子強(qiáng)度增高時(shí)，電流強(qiáng)度會隨著增大。不僅降低分辨率，而且在嚴(yán)重時(shí)會燒斷濾紙或熔化瓊脂糖凝膠支持物。 ?電流強(qiáng)度過低，生熱少，電泳時(shí)間延長，引起待分離生物大分子擴(kuò)散的增加而影響分離效果。 ?電泳實(shí)驗(yàn)中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶鰪?qiáng)度，同時(shí)可以適當(dāng)冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。 電滲 ? 當(dāng)支持物不是絕對惰性物質(zhì)時(shí)，常常會有一些離子基團(tuán)如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠近支持物的溶液相對帶電。在電場作用下，此溶液層會向負(fù)極移動。反之，若支持物的離子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù)離子，則溶液層會向正極移動。這種溶液層的泳動現(xiàn)象稱為電滲。 ?電泳電場中，液體也會相對固體支持介質(zhì)發(fā)生移動，出現(xiàn)電滲現(xiàn)象。在 pH值高于 3時(shí)，玻璃表面帶負(fù)電，吸附溶液中的正電離子，引起玻璃表面附近溶液層帶正電，在電場的作用下，向負(fù)極遷移，帶動電極液產(chǎn)生向負(fù)極的電滲流。 ?當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方向一致時(shí)，則加快顆粒的泳動速度；當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方向相反時(shí)，則降低顆粒的泳動速度。 支持介質(zhì)的篩孔 ?支持介質(zhì)的篩孔大?。ㄈ纾涵傊途郾０纺z都有大小不等的篩孔）對待分離生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。 ?在篩孔大的介質(zhì)中泳動速度快，反之，則泳動速度慢。 ?除上述影響泳動速度的因子外，溫度和儀器裝置等因子的影響也應(yīng)考慮。 第四節(jié) 電泳的分類 電泳按其分離的原理分類 按支持介質(zhì)的分類 按支持介質(zhì)形狀分類 按用途分類 按所用電壓分類 電泳按其分離的原理分類 ⑴ 區(qū)帶電泳：電泳過程中，待分離的各組分在支持介質(zhì)中被分離成許多條明顯的區(qū)帶，應(yīng)用最廣。 ⑵ 自由界面電泳： 這是瑞典 Uppsala大學(xué)的著名科學(xué)家 Tiselius最早建立的電泳技術(shù)，是在Ｕ形管中進(jìn)行電泳，無支持介質(zhì)，分離效果差，已被取代。 ⑶ 等速電泳：需使用專用電泳儀，電泳平衡后，各電泳區(qū)帶相隨，分成清晰界面，以等速向前運(yùn)動。 ⑷ 等電聚焦電泳：兩性電解質(zhì)在電場中自動形成 pH梯度，當(dāng)被分離的生物大分子移動到各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶。 按支持介質(zhì)分類 ⑴ 紙電泳（ Paper electrophorisis） ⑵ 醋酸纖維薄膜電泳 （ Cellulose Acetate electrophoresis） ⑶ 瓊脂凝膠電泳（ Agar Gel electrophoresis） ⑷ 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ Polyacrylamide Gel electrophoresis， PAGE） ⑸ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE）。 按支持介質(zhì)形狀分類 ⑴ 薄層電泳