雙向電泳原理及實(shí)驗(yàn)步驟(參考版)
2025-05-02 04:57本頁面
【正文】 謝 謝 ！ 。 ? BioSafe染色 1小時(shí)。 3. 電泳結(jié)束后 ， 輕輕撬開兩層玻璃 ， 取出凝膠 ， 并切角以作記號(hào) （ 戴手套 ， 防止污染膠面 ） 。 將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中 。 4. 放置 5分鐘 ， 使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固 。 2. 將放有膠條的 SDSPAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上 ， 在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液 （ 圖 6） 。 4. 放置 5分鐘 ， 使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固 。 2. 將放有膠條的 SDSPAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上 ， 在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液 （ 圖 6） 。 4. 放置 5分鐘 ， 使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固 。 2. 將放有膠條的 SDSPAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上 ， 在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液 （ 圖 6） 。 配制 1 電泳緩沖液 。 將玻璃板倒扣在桌面上 。 6. 第二次平衡 ， 振蕩 15分鐘 。 振蕩 15分鐘 。 3. 吸去膠條上的礦物油及多余的樣品 。 膠條的平衡 1. 冰箱中取出的膠條 ， 于室溫放置 10分鐘 。 聚合 30分鐘 。 （ 3050?A/根 ） l 設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度 。 等電聚焦程序的設(shè)置 7cm膠條 水化 12小時(shí) （ 17℃ ） 被動(dòng)水化 S1 250V 慢速 30分鐘 除鹽 S2 1000V 快速 60分鐘 除鹽 S3 4000V 線性 3小時(shí) 升壓 S4 4000V 快速 24,000伏小時(shí) 聚焦 ~28,000伏小時(shí) S5 500V 快速 任意時(shí)間 保持 l 選擇所放置的膠條數(shù) 。 6. 對(duì)好正 、 負(fù)極 ， 蓋上蓋子 。 4. 將 IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中 （ 圖 3） 。 2. 在聚焦盤或水化盤中加入樣品 （ 圖 1） 。 7. 設(shè)置等電聚焦程序 。 5. 在每根膠條上覆蓋 1ml礦物油 。 3. 去除預(yù)制 IPG膠條上的保護(hù)層 （ 圖 2） 。 等電聚焦的操作 1. 取出 IPG預(yù)制膠條 （ 7cm pH 47） ， 室溫平衡 。 6. 對(duì)好正 、 負(fù)極 ， 蓋上蓋子 。 4. 將 IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中 （ 圖 3） 。 2. 在聚焦盤或水化盤中加入樣品 （ 圖 1） 。 蛋白與蛋白之間由于可被熒光團(tuán)修飾的功能基團(tuán)數(shù)目不同而使得靈敏度變化很大 – 熒光團(tuán)的加入會(huì)降低蛋白質(zhì)溶解性能 。 ? BioRad有兩種銀染試劑盒： – 普通銀染試劑盒 ——質(zhì)譜不兼容 – 增強(qiáng)型銀染試劑盒 ——質(zhì)譜兼容 熒光染料 ? SYPRO Ruby染料 – 靈敏度 210ng， 靈敏度與銀染相仿 ， 不對(duì)核酸染色 – 染色所需時(shí)間較短 – 染色的動(dòng)態(tài)線性范圍大大優(yōu)于膠體金染色 ， 擴(kuò)展了約 1000倍 。普通的銀染過程中因醛類的特異反應(yīng)，而與下游質(zhì)譜不兼容。安全無污染，染色非?？欤?2小時(shí)），完全與下游質(zhì)譜兼容。 ? 膠體考馬斯亮藍(lán)染色的檢測(cè)靈敏度為 810ng，但染色時(shí)間較長(zhǎng)（ 2448小時(shí)），染色過程給下游質(zhì)譜檢測(cè)帶來較多不便。 : x cm, hr 1,724 spots 聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測(cè) 理想顯色劑的 7S ? 安全 （ safety） ： ? 靈敏 （ sensitivity） ： ? 簡(jiǎn)單 （ simplicity） ： ? 特異性 （ specificity） ： ? 快速 （ speed） ： ? 穩(wěn)定 （ stability） ： ? 兼容性 （ synergy） ： 適用于質(zhì)譜的染色方法 ? 考馬斯亮蘭（ BioSafe? Coomassie? colloidal 250 stain） ? 銀染（ Silver Stain Plus? stain ） ? 熒光染色（ SYPRO174。 : x cm, 1 hr 1,287 spots 1176。 : x cm, 40 min 944 spots 1176。 Second Dimension SDSPAGE Multiple Gel Formats Mini Criterion PROTEAN 1176。 二維 SDSPAG
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