雙向電泳原理及實驗步驟-在線瀏覽
2025-06-16 04:57本頁面
【正文】 IPG Effective Strip pH Overlapping Length Range Gel Area 24 cm 310 56 cm 18 cm 310 44 cm 17 cm 310 40 cm 11 cm 310 26 cm 7 cm 310 16 cm 聚焦時間的優(yōu)化 ? 要獲得高質(zhì)量的圖譜以及很好的試驗重復(fù)性，所需的最佳時間即為等電聚焦達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。 ? 聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 IEF的基本條件 Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total voltage Time VoltHours Ramp 250 20min －－－ Linear 4000 4000 2hr －－－ －－－ 10,000Vhr Linear Rapid 5 hr 14,000Vhr 7 cm Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total total Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 11 cm 17 cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ 20,000Vhr 40,000Vhr ～ 30,000Vhr ～ 50,000Vhr hr 7 hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid 兩維間的平衡 ? 等電聚焦電泳結(jié)束后可馬上進(jìn)行第二向電泳，也可于－ 80176。 ? 但在第二向電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與 SDS完整結(jié)合，從而使 SDSPAGE電泳能順利進(jìn)行。如果用 TBP代替 DTT則只需一步平衡。 ? 但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為在 IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性 IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠。 : 60 ?g sample, 20 kVhr 2176。 : 100 ?g sample, 50 kVhr 2176。 : 150 ?g sample, 80 kVhr 2176。 Ruby protein gel stain） 考馬斯亮藍(lán)染色 ? 考馬斯亮藍(lán)檢測范圍 30100ng，靈敏度較低，但染色過程簡單，所需試劑少，操作簡便，無毒性，染色后背景及對比度好，與下游質(zhì)譜兼容，線性程度好。 ? BioSafe染料 是一種改良的膠體金染色方法。 銀染 ? 銀染的檢測靈敏度很高，可達(dá)到 200pg，但其線性很差。 ? 快速銀染法，可與下游質(zhì)譜兼容，但其檢測靈敏度較低，并伴有很深的背景干擾。 – 熒光試劑顯色對蛋白質(zhì)無固定作用 ， 不干擾質(zhì)譜或免疫檢測過程 ? Cy3和 Cy5 – 兩種染料可分別對兩種蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記 ， 在一塊2D膠上同步運行 ， 可以很方便的找出差異 – 但因其需要對蛋白質(zhì)進(jìn)行共價修飾 、 改變了標(biāo)記蛋白質(zhì)的移動性能 – 由于熒光探針猝滅作用會引起快速衰減 。 凝膠的圖像處理分析 典型流程 ? 凝膠圖像的掃描： ? 圖像加工： ? 斑點檢測和定量： ? 凝膠配比： ? 數(shù)據(jù)分析： ? 數(shù)據(jù)呈遞和解釋： ? 2DE數(shù)據(jù)庫的建立： 綜合的數(shù)據(jù)管理 PDQuest Image Differential Analysis Spot Cutting Protein Digestion Mass Spec PMF / MSMS Global Database Search / Protein ID PDQuest Image Autoannotation PDQuest Work Flow Acquire the Image Transform the Image Identify the Spots Compare Images Analyze the Data Excise Spots Acqui
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