第五章雙向凝膠電泳2d-page-在線瀏覽
2024-09-11 13:14本頁面
【正文】 相對分子質量大小進行 SDSPAGE 第二次電泳分離。 移動過程中 ， 蛋白分子可能獲得或失去質子 ， 并隨著移動的進行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當?shù)鞍讛U散到低于其等電點 pH 區(qū)域時，帶正電荷，在電場的影響下重新向陰極移動 。根據(jù)各自不同的等電點，蛋白質最終被聚焦在一個很窄的 pH 梯度介質區(qū)域內。 第二向是將在 IPG 膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質轉移到 SDSPAGE凝膠上，根據(jù)蛋白質的相對質量或分子量 (MW) 大小與第一向相垂直的分離。樣品經(jīng)過電荷和質量兩次分離后，得到等電點和分子量的信息。 在 ISODALT系統(tǒng)中，等電聚焦在聚丙烯酰胺管膠 (tube gel) 中進行，載體兩性電解質 (carrier ampholyte) 在外加電場的作用下形成 pH梯度， pH梯度在堿性區(qū)不穩(wěn)定（陰極漂移）、重復性不易掌握和上樣量低是其主要缺點，并且一般不能分離等電點大于 ，其優(yōu)點是電泳設備要求不高，電泳溶液容易配制，易于開展工作，各種電泳條件經(jīng)優(yōu)化后，可達到非常高的分辨率，也可獲得好的重復性，目前唯一分辨到 10000個蛋白質斑點的圖譜正是采用了這一系統(tǒng)。 IPGDALT的第一向電泳是采用 1982年發(fā)明的 IPG膠 (Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG et al. Isoelectric focusing in immobilized pH gradient: principle, methodology and some applications. J Biochem Biophys Methods, 1982, 6: 317339)，其 pH梯度的形成依賴于不同 pK值的一種合成的化合物 immobiline，該化合物是丙烯酰胺的衍生物，為非兩性的弱酸和弱減，在凝膠聚合過程中，能與聚丙烯酰胺共價結合，因此， IPG膠的 pH梯度是穩(wěn)定的，不依賴于外加電場，基本上克服了 ISODALT的主要缺點，無論在重復性和上樣量上均優(yōu)于 ISODALT。適于分析非共價鍵連接的蛋白 蛋白間的相互作用。此時分離的蛋白質點可進行點的切取、蛋白酶消化、 MALDITOFMS分析鑒定，提供關于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。該技術適于 DNA序列和多肽結構的分析，或分析被碳氫鍵連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結構微異質性，但此方式顯示的大于 100KD的蛋白質點少于第三種方式。小時控制；重泡脹可采取整體的或獨立的步驟；程序可時時控制；可同時聚焦 24根 7cm， 12根 17cm膠條；有三個預設程序的方法；有十個用戶自定方法；采集運行數(shù)據(jù)可經(jīng) RS232端口輸出或任何熱敏打印紙。 1℃ ； 膠條槽 (Holder) 體為氧化鋁陶瓷，丙烯酸的蓋子；適合 1 13和 18cm的膠條 ； 程序參數(shù)包括重泡脹時間 、 平臺溫度 、 每根膠條的最大限流 、 每步的電壓 、 每步的電流改變模式 、 每步的時間 ； 可編輯 10個程序 ， 每個程序分有九個步驟 ； 電壓輸出最大為 8000V； 最大電流為 ； 最大功率為 12W。配套電源為 Power Pac 1000：在進行電泳時，最大電壓不超過 1000V，最大功率不超過 80W，最大室溫不超過 50℃ 。 (2) 使用 Gel caster灌膠模具：最多可同時灌 、 1mm厚的梯度膠或均一膠 14塊。最多可同時跑兩塊膠；跑一塊膠時需 ，跑兩塊膠時需 ； 最大電壓是 600V， 最大功率是 25W； 所配置電源為 Electrophoresis Power Supply EPS 301。 ? 防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 ? 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 特殊樣品的制備 低豐度蛋白的分離： 盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量 , 但同時增加了高豐度蛋白的負荷 ，且造成蛋白的疊加效應而影響分離 。 強堿性蛋白質 （ 如核糖體 ） 的處理： 先將蛋白預處理以富集 ， 再用特殊 pH梯度的 IPG膠條 （ 如 pH31 412或 1012) 進行等電聚焦 。 極端分子量的蛋白質： 小于 8kD和大于 200kD的蛋白在常規(guī) IPG2D上不易看到 ， 這可能是在 Tris/glycine緩沖液中 ， 樣品和游離的 dodelcyl sulfate ions持續(xù)積累濃縮 ， 與小分子量的蛋白質發(fā)生對流混合 ， 產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶 ， 從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端 ， 高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難 。 5. 雙向凝膠電泳技術流程 IPG重泡漲及樣品加樣 第一向等電聚焦 第二向 SDSPAGE 檢測 問題及解決辦法 IPG膠條的重泡脹 ? 重泡漲時間至少要 10h， 泡漲不充分會影響相對分子量較高的蛋白質的吸收 。 ? 不同的 加樣方法和加樣量 會導致最終結果的差異。 ? 重泡漲時加上 3050V的低電壓會促進膠條對蛋白質的吸收，但這一點在制備型電泳時才有意義。重泡漲液的成分是： 8mol/L Urea, 2% CHAPS, 18mmol/L DTT, %IPG Buffer, 痕量 Bromophenol Blue，和裂解液成分基本相同，在 10100mmol/L濃度范圍內適當提高 DTT的濃度可提高蛋白質的檢測靈敏度。 ? 泡脹的實質：是讓樣品能完全以可溶性的形式進入 IPG內，從而能進行接下來的 IEF。在陰極加上 20mmol/L DTT潤濕的紙片可減少堿性端的水平條紋并且有助于堿性蛋白質的聚焦。 ? 聚焦時間太短，會導致水平和垂直條紋
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