雙向凝膠電泳ppt課件(2)-展示頁
2025-05-12 18:46本頁面
【正文】 能進(jìn)行接下來的 IEF 常用的泡脹液的成分為 8M尿素， 2％的去污劑（ NP40,Triton X100,CHAPS),15mM DTT,% IPG buffer 蛋白載樣量 影響 IPG膠條對(duì)蛋白載樣量的因素包括： ? 電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的 IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。其中窄范圍堿性 IPG膠（如 pH1012）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性 IPG膠（如pH31 412）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。 現(xiàn)常用預(yù)分級(jí)＋窄 pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群 ， 再用 pH梯度小于 2個(gè)pH單位的 IPG膠進(jìn)行窄 pH范圍的分離 。 第一步：用 Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白； 第二步：把未溶解的 pellet用標(biāo)準(zhǔn) IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白； 第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個(gè)樣品的11%（ W/W）。但該法需要專業(yè)儀器，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性。 亞蛋白質(zhì)組樣品的制備 ?用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。 樣品中核酸的去除 ? 對(duì)電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。濃度過高會(huì)使 IEF的速度降低。 Carrier ampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。常用含自由巰基的 DTT或 ?巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（ TBP）進(jìn)行還原。其中 CHAPS和 SB310最好。 表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。 增加樣品溶解性的手段 變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。 樣品的溶解 ? 是 2DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。 可溶性樣品 固體組織樣品 細(xì)胞 不同樣品的基本處理方法 樣品的分級(jí)處理 通過采用亞細(xì)胞分級(jí)、液相電泳和選擇性沉淀等方法對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。 ? 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 ? 防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 1975年， O‘FarrellL、 Kloset和 Scheele分別對(duì)雙向 凝膠電泳做進(jìn)一步的優(yōu)化，建立了高分辨的雙向凝膠電泳。 1969年，雙向凝膠電泳 在原理上有了新的發(fā)展，以第一向?yàn)榈鞍踪|(zhì)等電聚焦的雙向 凝膠電泳建立起來 (即 IEFPAGE)。第八課 雙向凝膠電泳 ? 概述 ? 原理 IEF， SDSPAGE ? 雙向凝膠電泳分離操作 ? 雙向凝膠電泳檢測 ? 雙向電泳分離技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn) ? DI GE技術(shù) 一、雙向凝膠電泳概述 雙向電泳的思路最早由 Smithies和 Poulikc提出，蛋白質(zhì)第 一向電泳是根據(jù)其自由溶液遷移率 (freesolutionmobility)， 在濾紙條上進(jìn)行；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠 上進(jìn)行。 隨著聚丙烯酰胺凝膠的發(fā)明，雙向電泳支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向 聚丙烯酰胺凝膠，即雙向凝膠電泳。 20世紀(jì) 70年代初，第二向電泳中使用了十二烷基硫酸鈉 (SDS)，使第二向電泳基本上根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量來 分離，從而奠定了現(xiàn)代雙向凝膠電泳的基礎(chǔ) (即 IEFSDS PAGE)。 雙向電泳分析中的樣品制備 制備原則 ： ? 應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。 ? 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。 ? 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。當(dāng)前最簡單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。 ? 溶解的目標(biāo)： 樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使 2DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降）； 溶解方法必須允許可能干擾 2DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除； 溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。其典型代表是尿素和硫尿。常用的表面活性劑有離子去污劑 SDS、非離子去污劑Triton X100和 NP兩性離子去污劑 CHAPS、OBG等。 還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。 起載體作用的兩性電解質(zhì)：即
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