雙向凝膠電泳ppt課件(2)-文庫吧資料
2025-05-09 18:46本頁面
【正文】 ） ， 蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如 EDTA或 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì) 。 熒光染色的優(yōu)缺點(diǎn) ? 對(duì)蛋白無固定作用 ? 與質(zhì)譜兼容性好 ? 靈敏度較高與銀染相仿 ? 線性范圍遠(yuǎn)高于銀染 ? 與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，可能改變蛋白的遷移性能 ? 熒光淬滅 ? 降低蛋白溶解度 用 SYPRO Ruby對(duì) 2D電泳后的膠染色圖 利用 Sypro Ruby染色后的 2D膠分析圖譜 SYPRO Ruby進(jìn)行染色的優(yōu)缺點(diǎn) ? 靈敏度高：比銀染高 3～ 30倍 ? 線性動(dòng)態(tài)范圍廣 ? 不對(duì)核酸染色（熒光染料 SYPRO Rose染核酸） ? 染色時(shí)間不嚴(yán)格，用擔(dān)心染色過度 ? 不干擾后續(xù)的質(zhì)譜及免疫學(xué)檢測(cè) ? 染料本身及掃描儀價(jià)格昂貴 Comparison of fluorescent labeled 2D gel with silver staining CyTM5 labelled gel Silver stained gel E. coli lysate, 50?g loading, pH 47 負(fù) 染 ? 能專門提高 PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率 ， 但不能用于膜上染色 。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室 300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存 ， 其線性范圍為 3個(gè)數(shù)量級(jí) 。后者最為常用 ， 其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等熒光染料 。 ? 這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。 ? 膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn) PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為 8~10ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。 ? 但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因?yàn)樵?IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性 IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠。如果用 TBP代替 DTT則只需一步平衡。 ? 但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與 SDS完整結(jié)合，從而在 SDSPAGE是電泳能順利進(jìn)行。 IEF的基本條件 Step 1 Step 2 Step 3 total voltage Time VoltHours Ramp 250 20min －－－ Linear 4000 4000 2hr －－－ －－－ 10,000Vhr Linear Rapid 5 hr 14,000Vhr 7 cm Step 1 Step 2 Step 3 total total Step 1 Step 2 Step 3 11 cm 17 cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ 20,000Vhr 40,000Vhr ～ 30,000Vhr ～ 50,000Vhr hr 7 hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid Protean IEF cell、 IPGphor等集成設(shè)備 兩維間的平衡 ? 一維結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－ 80176。 ? 過度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在 IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。 (防止低溫尿素結(jié)晶） IPG IEF 中的溫度 聚焦時(shí)間 ? 理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時(shí)間是 IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。 ? IPG膠條的 pH范圍 IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量 IPG Strip length Analytical Load (silver staining) Preparative Load (Coom staining) 7cm 10~100 ? g /125 ? l 200~500ug/125 ? l 11cm 50~200 ? g /185 ? l 250~1000ug/185 ? l 17cm 100~300 ? g/300 ? l 1~3mg/300 ? l IPG IEF 中 pH梯度的選擇 ? 常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗(yàn)確定。 ? 不同的加樣方法和加樣量（根據(jù)顯色方法） ? 待研究蛋白的豐度 ? 樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。 Immobilized pH Gradient (IPG) IPG膠條的重泡脹 ? 泡脹的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入 IPG內(nèi)，從而
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