實驗二sdspage凝膠電泳-文庫吧資料
2025-05-05 05:54本頁面
【正文】 干燥。如果無法獲得無色透明的 TEMED，只能適當增加用量以保證聚膠速度。 2. 注意不能隨便傾倒 單體溶液 ，應加入過量的催化劑使其完全聚合成無毒性的聚丙烯酰胺后再棄置。 混合樣品 帶孔膠 按分子大小分離 電泳方向 電泳 小分子 大分子 夾在兩塊玻璃板之間的凝膠 電泳緩沖液 電泳緩沖液 加在槽中的經SDS處理的樣品 分子量小 分子量大 電源 電泳后的凝膠經考馬斯亮藍染色、脫色后的凝膠照片 圖 1 標準蛋白質與待測樣品電泳圖譜 94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 注：膠槽 1 標準蛋白；膠槽 3 樣品蛋白 ７ .結果處理 標準蛋白分子量 未知蛋白 在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數與多肽鏈的相對遷移率成線性關系，所以可以通過標準曲線求未知多肽鏈分子量 。 電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。 7).染色脫色 培養(yǎng)皿中倒入 5060度預熱的染色液浸沒凝膠，約 40分鐘后回收染色液，用清水沖洗掉膠上多余的染色液。當溴酚蘭進入分離膠后，把電壓提高到 150V、 80mA，電泳至溴酚蘭距離膠底部 12cm處，停止電泳。上樣時要將移液槍頭垂直插入孔內且要緩慢勻速推入樣品。 3).樣品預處理 取 ，置沸水中煮 5分鐘。 ? ② 制備濃縮膠 ? 30%丙烯酰胺 + 濃縮膠緩沖液 1ml +10%SDS +10% AP + 蒸餾水 ml；混勻后加入 8ul TEMED,立即混勻（不能有氣泡），灌入垂直板至離槽沿 ，插入梳子（不能混入氣泡），靜置，待凝膠聚合后，加入電泳緩沖液，拔去梳子。 ? 2） 制備 SDS聚丙烯酰胺凝膠 ①制備分離膠 30%丙烯酰胺 5ml + 分離膠緩沖液 5ml +10%SDS +10%過硫酸銨 + 蒸餾水 ml；混勻后加入 8ul TEMED,立即混勻（不能有氣泡），灌入安裝好的垂直板中，灌膠時要勻速貼壁流入，防止氣泡產生。 ? 1） .安裝膜具 ? ① 將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干 , 將凡士林均勻的涂在兩側的封條上，用封條將玻璃板封好。 (3) 將灌膠裝置準備好。 （ 13）樣品：兔血清 ２ . 聚膠前準備 (1) 配制 10％過硫酸銨溶液 (需每天新鮮配制 )。 4℃ ， 1～ 2月 （ 2） 10%SDS（十二烷基磺酸鈉） （ 3） ()： 稱取 Tris , 加入 50ml水 ,用 1mol/L鹽酸調,最后用蒸餾水定容至 100ml。該法是 1976年 Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為 0～ 1000μg／ mL，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。 染色劑 考馬斯亮藍染色 常用染色方法 銀染法 金屬離子染色法 以考馬斯亮藍染色為例 考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質 ― 染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。常用 ～ ?的濃度作為固定液。甲醇固定的特點是殺死快，滲透力強，對組織收縮較大 (可收縮 20?左右 )，可使材料變硬 。 甲醇 /冰醋酸固定液 甲醇 /冰醋酸固定液 甲醇 ： 有固定、硬化和脫水的作用。 上樣緩沖液 之四 單純的固定液一般難以達到這些要求，因此在實驗中使用兩種混和的固定液。 上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴散出來到電泳緩沖液中。 4. 通常電泳時染料到達膠的底端附近（ ～1cm)即可停止電泳。 2. 100℃ 或沸水浴加熱 3～ 5min，以充分變性蛋白。 上樣緩沖液 之二 ?注意事項 還原型上樣緩沖液中含一定量的 DTT（二硫蘇糖醇） 或巰基乙醇，有輕微刺激性氣味，較易區(qū)分； 含巰基的試劑有一定的毒性，為了安全和健康，應穿 實驗服并戴一次性手套操作 。 上樣緩沖液之一 上樣緩沖液 (SDSPAGE l
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