凝膠電泳ppt課件(2)-文庫吧資料
2025-05-08 12:02本頁面
【正文】 堿變性 化學(xué)試劑變性 。 核酸分子雜交（ DNA/DNA or DNA/RNA）技術(shù) ? 核酸分子雜交技術(shù)，是在 1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（ Cavnegie Institute of Washington）的 Roy Britten及其同事發(fā)明的。 檢測樣品中是否含有特定 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 （ mRNA） 及其含量 。 Southern雜交： 即 DNADNA雜交分析 ， 檢測樣品中特定 的 DNA及其含量 。 ? 作用：用于檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì) 是否存在 ，以及其 相對分子質(zhì)量的大小 。 ? ? 三、分子雜交 ? 分子雜交：指具有一定 同源序列 的兩條核酸單鏈（ DNA或 RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經(jīng)過退火處理，形成 異質(zhì)雙鏈 的過程。 回收 DNA片段質(zhì)量 凝膠材料的質(zhì)量，如瓊脂糖中的硫酸鹽 沉淀劑若改用精胺，它可有效地去除 PEG、核苷酸、鹽、聚丙烯酰胺及蛋白質(zhì)等。 mRNA翻譯產(chǎn)物 ， 基因表達(dá)產(chǎn)物測定等 。 蛋白質(zhì)電泳 方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 ， 前者常稱之為 SDSPAGE。 步驟： RNA+10mM羥甲基醛 點樣在含 4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上 電泳 染色觀察 3. 甲醛法 步驟： RNA+ +50%甲胺 點樣在含 糖凝膠上 MOPS緩沖液電泳 染色觀察 其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于 RNA電泳 . 4. 三種方法的比較 第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的 RNA樣品用于體外翻譯效果不好。這些方法不僅要使 RNA分子在點樣時是一級結(jié)構(gòu)，而且在整個電泳過程中也保持一級結(jié)構(gòu)。 DNA雙鏈互補，但組成不一樣，仍可分離（機理不詳），電泳時形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。 : 不受影響 ,溫度高可導(dǎo)致 DNA帶變形或解鏈。 操作難易 2. 用途 瓊脂糖凝膠用于 DNA和 RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。 種類 1) 按凝膠材料分 : 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳 (普通瓊脂糖和低熔點瓊脂糖 ) 2) 按電泳裝置分 : 水平式 /瓊脂糖凝膠 。 4 溫度： 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖電泳基本在室溫進(jìn)行，PFGE一般應(yīng)在 4℃ 進(jìn)行。 2 電壓： 若固定脈沖時間，增加電場強度就增大了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場強度會導(dǎo)致較小片段泳動的紊亂。 ?與分子量小的 DNA分子相比，分子量大的 DNA分子需要較多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使之能夠按新的方向游動，所以遷移率就慢，從而達(dá)到了分離大分子量 DNA分子的目的。整個電泳 移動方向與兩電場呈 45o，在電泳過 過程保持電壓穩(wěn)定。 B+ A +A B 脈沖電場電泳示意圖 脈沖場凝膠電泳原理圖 北 南 脈沖場電泳 常規(guī)電泳 兩組電極，排列不均勻 。 分離超大分子量的DNA分子 。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?Polyacrylamide Gel Electrophoresis ， PAGE ?緩沖液： TBE ?凝膠聚丙烯酰胺電泳： ? 丙稀酰胺 / 亞甲雙丙稀酰胺（ 29： 1）； ? TEMED（四甲基乙二胺，加速劑） ? 過硫酸銨（ 10％，催化劑 ）。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉 (sodium dodecyl sulfate,簡稱 SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。 （三） DNA在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍 丙烯酰胺濃度（ %） 有效分離范圍（ bp） 二甲苯氰 FF 溴酚藍(lán) 1000~2022 460 100 80~500 260 65 60~400 160 45 40~200 70 20 25~150 60 15 6~100 45 12 注 :N,N`亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的 1/30。 注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。 用途：放射性 DNA探針的分離、 DNA測序反應(yīng)等。 丙烯酰胺 N,N’甲叉雙丙烯酰胺 原理 聚丙烯酰胺凝膠三維結(jié)構(gòu) 聚丙烯酰胺凝膠電泳種類 1 變性聚丙烯酰胺凝膠 用于單鏈 DNA片段的分離或純化。 DNA分子的雙鏈中，在紫外光的照射下，插入溴化乙錠的 DNA呈橙紅色熒光，所以溴化乙錠可以作為熒光指示劑指示 DNA含量和位置。 6. 電泳儀有電壓顯示，并不一定標(biāo)志電泳槽已接通，應(yīng)觀察電極氣泡出現(xiàn)情況。 4. 加樣時， Tip頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或 DNA帶型不整齊。 3. EB具有強誘變性，可致癌。 （ 2）瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)： ? 緩沖液： 1 TAE（ TBE TPE） ? 凝膠的含量：根據(jù)檢測的 DNA大小 ? 加 DNA樣品： 1μg，指示劑 溴酚藍(lán) ? 電泳條件：大片斷低電壓長時間，小片段高電壓短時間 (5V/cm) （ 2）瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)： ?染色和觀察：溴化乙錠（ ethidium bromide， EB）染色，在 300nm波長的紫外下觀察（凝膠成像儀）， 能看到 μg的微量 DNA ?DNA的片斷大小與熒光強度成正比 操作 預(yù)染色的標(biāo)本 用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn) DNA對 DNA片斷大小的估算 Sample
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