sdspage凝膠電泳(1)-文庫(kù)吧資料
2025-05-13 18:13本頁(yè)面
【正文】 緩沖液 ,用于常規(guī)的 SDSPAGE蛋白電泳樣品上樣。 甘氨酸 ? 此處 pH值較高， 有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過(guò)堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動(dòng)。 因此通過(guò) 已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可以得出未知蛋白的分子量。 符合如下方程式： Lg MW =－ b ? m R + K 其中， MW 為蛋白質(zhì)的分子量， m R 為相對(duì)遷移率，b為斜率， K為截距。 ? SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而 消除或掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差異 ，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量的差異將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。 實(shí)驗(yàn)中各成分作用 ? 聚丙烯酰胺 ? SDS ? 甘氨酸 ? 上樣緩沖液 ? 固定液 ? 染色劑 丙 烯 酰胺 N,N’亞甲基雙 丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 四甲基乙二胺 (TEMED) 過(guò)硫酸胺 (AP) 激活作用 激活作用 共聚合 被激活的單體和未被激活的單體反應(yīng)開(kāi)始了多聚鏈的延伸，正在延伸的多聚鏈也可以隨機(jī)地通過(guò) Bis的作用進(jìn)行交叉互聯(lián)成為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最終多聚物聚合成凝膠狀，而其孔徑大小等特征由聚合條件及單體濃度決定。 分離范圍 ? 凝膠的篩分特性取決于它的孔徑 ， 而孔徑又是灌膠時(shí)所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對(duì)濃度的函數(shù) 。 這些小孔的孔徑隨 “ 雙丙烯酰胺～丙烯酰胺 ” 比率的增加而變小 ， 比率接近 1： 20 時(shí)孔徑達(dá)到最小值 。 ? SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的 聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度 。因此，各種 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳中不同的泳動(dòng)率只反映了蛋白質(zhì)分子量的不同。此時(shí)蛋白質(zhì)在均一的外加電場(chǎng)下泳動(dòng)，但由于蛋白質(zhì)分子所帶的有效電荷不同，使得各種蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率不同而形成一條條區(qū)帶。這種濃縮效應(yīng)可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。在快離子和慢離子之間形成一個(gè)穩(wěn)定而不斷向陽(yáng)極移動(dòng)的界面。電導(dǎo)與電壓梯度成反比，所以低電導(dǎo)區(qū)有較高的電壓梯度。其有效泳動(dòng)率依次為 Cl＞蛋白質(zhì)＞ H2NCH2COO，故 C1稱(chēng)為快離子，而H2NCH2COO 稱(chēng)為慢離子。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)一般在 pH=5左右，在此條件下其解離度在 HCl和甘氨酸之間。在上下電泳槽內(nèi)充以 Tris甘氨酸緩沖液 ()，這樣便形成了凝膠孔徑
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