20xx年醫(yī)學(xué)專題—脈沖場凝膠電泳-文庫吧資料
2024-11-18 23:14本頁面
【正文】 純化、沉淀 3) 透析袋法—切下含DNA帶瓊脂塊 放入透析袋，封口 放入電泳槽 電泳2~3小時至全部DNA離開凝膠塊 反向電泳1分鐘 取出DNA液 純化、沉淀 4) 凍融法 5) 酶解法,第二十五頁，共三十八頁。,五、核酸片段的分離與回收 1.方法 —用于DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的回收 1) 電洗脫法: 利用(l236。mRNA翻譯產(chǎn)物，基因表達(dá)產(chǎn)物測定等。 五、蛋白質(zhì)電泳 方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為SDSPAGE。 hǎo)。 步驟：RNA+10mM羥甲基醛 點樣在含4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上 電泳 染色觀察,第二十三頁，共三十八頁。ng)中也保持一級結(jié)構(gòu)。這些方法不僅要使RNA分子在點樣時是一級結(jié)構(gòu)，而且在整個電泳過程(gu242。,核酸定序凝膠(染料指示劑)：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生(chǎnshēng)二級結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）,第二十二頁，共三十八頁。n yǒnɡ): 常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定 5) 線狀ssDNA電泳 鏈分離凝膠：化學(xué)定序時，用于單鏈分離。,第二十一頁，共三十八頁。nɡ)的。nɡ)大小DNA片段遷移率增大是不同(b249。)因素的影響： i. 分子量 的大小: 遷移距離與分子量的常用對數(shù)成反比 ii. 凝膠濃度: 濃度越高，移動距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動距離越長，適合分離高分子量DNA,iii.電壓: 低電壓時，遷移率與電壓成正比；電壓增高時，不同(b249。 3. 凝膠電泳的一般程序 制膠 點樣 電泳 染色 觀察 二、DNA電泳 1. DNA分子種類 1) 線狀DNA—單鏈與雙鏈，ssDNA電泳時要注意局部區(qū)域形成dsDNA，造成遷移距離不確定 2) 環(huán)狀DNA—單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒DNA） 3) 線狀dsDNA電泳—使用頻率最高的一種電泳,第二十頁，共三十八頁。 操作難易 2. 用途 瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)(ch225。,1. 種類 1) 按凝膠材料分: 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊脂糖和低熔點瓊脂糖) 2) 按電泳裝置分: 水平式/瓊脂糖凝膠。,第十八頁，共三十八頁。,ii. 親和層析法： 低聚dT纖維素: 用于poly(A)較長的mRNA； 多聚U瓊脂糖: 用于poly(A)較短的mRNA（20A） RNA進(jìn)樣吸附 洗滌 洗脫 收集(shōuj237。,***免疫親和層析法 新生肽鏈抗體復(fù)合物 不溶性交聯(lián)抗原基 質(zhì)親和層析柱吸附 洗脫 免疫沉淀法優(yōu)點：可分離到含量僅為1%的mRNA，但必須使用高純度的抗體，不能發(fā)生(fāshēng)交叉反應(yīng)和污染核酸酶 2) 多聚核糖體RNA的分離 純化多聚核糖體+SDS 蔗糖密度梯度離心或蛋白酶K苯酚抽提 4. RNA的分級分離 1) 分子量大小分級分離 i. 蔗糖密度梯度離心 ii. 凝膠電泳 2) 核酸序列分級分離 i. 分子雜交法：適用于同源性很高的RNA的分離 DNA分子變性 結(jié)合到NCF RNA ii. 核糖體大小分級分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的 多聚核糖體 iii.核糖體免疫沉淀法 *直接免疫沉淀法 新生肽鏈+抗體(k224。) ① 超速離心法（3040萬g，離心23 h） ② 鎂鹽沉淀法（0.1 M Mg++） ③ 分級分離法—分離特異性多聚核糖體,第十四頁，共三十八頁。在RNA制備中，細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的。,其中以胍鹽法最好，對于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取(t237。 抗高溫嚴(yán)寒(0~65℃均具活性）；抗變性劑 2) 解決辦法：外源RNase—高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（Tris 變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法 上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNA R
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