雙向凝膠電泳ppt課件-文庫吧資料
2025-05-18 06:39本頁面
【正文】 聚焦盤內(nèi)加樣。 ? 商品化的膠條使用前是以干膠條的形式和塑料支撐薄膜粘在一起，加樣前需要先撕去薄膜在重泡漲液中泡漲。 ? 溫度的選擇：重泡漲及等電聚焦時(shí)溫度一般穩(wěn)定在 20℃ ，太低尿素會(huì)結(jié)晶出來，溫度不穩(wěn)也會(huì)造成膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)位置的變化。 ? 重泡漲液的體積和膠條的長度相匹配，操作時(shí)需參照相關(guān)說明書。 至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下 ， 蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽 ， 或者可能是大分子 。 其中窄范圍堿性 IPG膠 （ 如 pH1012) 的挑戰(zhàn)是克服反向 、 陰極向陽極 、 電滲流和水平條紋模式 ， 而寬范圍的堿性 IPG膠 （ 如 pH31 412) 等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液 。 現(xiàn)常用預(yù)分級(jí)＋窄 pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群 ，再用 pH梯度小于 2個(gè) pH單位的 IPG膠進(jìn)行窄 pH范圍的分離 。 ? 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。 ? 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。 圖像分析軟件： ? Amersham pharmcia Biotech公司： imageMasterTM 2D version: ? BIORAD公司： PDQuesTM 4. 雙向電泳分析中的樣品制備 ? 應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。 Amersham pharmcia Biotech公司 Hoefet miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit： 膠大小為 8cm 。 Amersham pharmcia Biotech公司 Ettan DALT II System： (1) 此系統(tǒng)的電源控制為 Power Supply/Control Unit：最大輸出功率是200W；溫度控制范圍是 1050℃ 最大電壓 600V；最大電流 1A。 第二向： BIORAD公司 PROTEAN II xi Cell電泳槽： 電極是直徑為 ；適用于 20cm 凝膠電泳；凝膠厚度為 ；可同時(shí)運(yùn)行 12塊膠；上槽緩沖溶液 350ml，下槽緩沖溶液 L；典型 SDSPAGE電泳時(shí)間：無冷卻時(shí)為 5小時(shí)，帶冷卻時(shí)為 。 BIORAD公司 PROTEAN IEF Cell 等電聚焦儀： Amersham pharmcia Biotech公司 IPGphor等電聚焦儀： 電極區(qū)域?yàn)殂~鍍金板 ； 最多上 12個(gè)樣品 ； 平臺(tái)溫度為 1825℃ 177。 雙向電泳的分類 3. 儀器簡介 第一向： 采用珀耳帖溫度控制聚焦平臺(tái)；最大電壓為 10, 000伏；有不同的電壓上升方式；可分步進(jìn)行時(shí)間或電壓 ? 變性 2DPAGE：樣品先用 2%SDS + 5%β ME + 95℃ 變性 5min, IEF在 8M尿素 + 1%NP40條件下進(jìn)行，之后膠條用 2%SDS + 5%β ME平衡，然后進(jìn)行 SDSPAGE。 ? 非變性 /還原 /SDS2DPAGE：非變性條件下 IEF聚焦，之后用8M尿素 + 5%β ME + 2%SDS進(jìn)行平衡，再進(jìn)行第二向 SDSPAGE電泳。 ? 非變性 2DPAGE：兩向均在非變性條件下進(jìn)行，這樣分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和表觀分子量同生理?xiàng)l件下獲得的這些蛋白的值是一樣的； ? 非變性 /SDS2DPAGE：第一向采用非變性 IEF，之后在 2% SDS溶液中平衡；第二向也在 SDS存在的條件下進(jìn)行。 NEPHGE為非平衡 pH梯度電泳 (nonequilibrium pH gradient electrophoresis)，是 IPG (immobilized pH gradient) 膠發(fā)明前用于分離堿性蛋白質(zhì)的一種方法，蛋白質(zhì)在等電聚焦場中達(dá)到平衡前結(jié)束電泳，第一向的 pH也是依靠載體兩性電解質(zhì)和電場來建立。 三種雙向凝膠等電聚焦系統(tǒng) 根據(jù)第一向等電聚焦條件和方式的不同，可將雙向凝膠電泳分為三種系統(tǒng)： ISODALT、 NEPHGE和 IPGDALT。沿垂直的方向進(jìn)行 SDSPAGE 電泳，按分子量大小進(jìn)行分離。目前常使用預(yù)制膠條 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的 IPG 膠條在含有 SDS 的緩沖液中平衡。 同樣 ， 如果蛋白質(zhì)擴(kuò)散到高于其等電點(diǎn)的 pH 區(qū)域時(shí)，則帶負(fù)電，在電場的作用下會(huì)向陽極移動(dòng)。當(dāng)?shù)鞍走w移至其等電點(diǎn) pH 位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動(dòng)。 第一向進(jìn)行等電聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點(diǎn)特性 ， 將蛋白質(zhì)樣品加載至 pH梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時(shí)，會(huì)向與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng) 。 此項(xiàng) 技術(shù)是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離并展示的分離技術(shù)，一般能分離 1000 – 3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，最好的膠能分離得到 11000個(gè)左右的蛋白質(zhì)點(diǎn)。 20世紀(jì) 70年代初，在第二向電泳中又使用了十二烷基磺酸鈉 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of nonhistone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165
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