雙向凝膠電泳ppt課件(2)-閱讀頁
2025-05-18 18:46本頁面
【正文】 Automated instrumentation ? Manual excision – trim slice to ~1mm3 *Run proper controls ?negative gel ?reagent alone WASH ? Organic/Aqueous – This will remove excess Coomassie Blue DEHYDRATE ? Soak in 100% acetonitrile, then remove – slices turn opaque white – be sure that acetonitrile is free of acid ? Dry slices in speedvac or lyophilizer – remember to wear gloves as the samples will be uncovered DIGEST ? Stocks of trypsin can be stored at 70176。l ? Rehydrate slices with trypsin solution – incubate while securely covered at 37176。 適于分析非共價鍵連接的蛋白－蛋白間的相互作用 。 此時分離的蛋白質(zhì)點可進行點的切取 、 蛋白酶消化 、MALDITOFMS分析鑒定 ， 提供關于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息 。 該技術適于 DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析 ， 或分析被碳氫鍵連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性 ， 但此方式顯示的大于 100Kd的蛋白質(zhì)點少于第三種方式 雙向電泳的分類 2DPAGE Strongpoints ?Control and experimental samples in the same gel ?Differencial expression analysis ?Reproducibility ?Reliability Statistically ?High Sensitivity ?Effectivity: a relatively large number of proteins ?Simple and relatively economical pared to LC 2DPAGE的分辨率和重復性 ?目前，一塊膠板 (16cm 20cm)可檢測到3000～ 4000個甚至 10000個蛋白斑點； ?80年代開始采用固定化 pH梯度膠的 IEF，克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等許多缺點而得以建立非常穩(wěn)定的可以隨意精確設定的 pH梯度，可建立很窄的 pH范圍 ()，對特別感興趣的區(qū)域做第二輪分析，大大提高了分辨率。 2DE的局限性 ? 低豐度蛋白、膜蛋白、堿性蛋白的分離與檢測 ? 重復性 ? 規(guī)模化與自動化 Strategies for increasing resolution ?Using large amount of samples ?To remove abundant proteins ?Using wide pH gradient immobilized gel strips (pH310) ?To try narrow pH gradient gel strips 預分步收集 細胞漿 細胞核 細胞膜 核糖體及其他特定細胞成份 細胞分泌成份 pH412 pH310 pH47 pH58 pH710 pH611 pH36 pH34 pH45 pH56 pH67 pH78 pH89 pH910 pH1011 pH1112 第一步 第二步 第三步 用窄 pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白 陣列那些亞細胞定位位置的功能蛋白質(zhì) 3倍 3倍 熒光差異雙向電泳 (DIGE) 技術路線 ?是將樣品在電泳前標記 Cy Cy3 和 Cy5 這 3 種熒光染料（其中Cy2 作為用 Cy Cy5 標記的蛋白質(zhì)內(nèi)標） ?將標記后的 3 種樣品混合 , 同時在一塊膠上進行電泳。 ?用于標記的熒光基團在化學結(jié)構(gòu)上相似 ,分子量也基本相同 ,都帶有正電荷 ,所以在與賴氨酸殘基反應時 ,保證了所有的樣品可以移至相同的位置。 Fluorescence 2D differential gel electrophoresis (F2D DIGE) 利用雙熒光標記在同一塊膠上進行兩組樣品的差異性比較 優(yōu)點 ?該方法提高了定量上的準確性。 ?不同的 CyDye（ Cy2, Cy3, Cy5）標記的樣品可以在同一塊膠上共分離，保證所有樣品在完全相同的第一向和第二向電泳條件下分離，消除實驗的偏差并保證精確的膠內(nèi)匹配。大大減少了一個實驗需要的膠
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