凝膠電泳ppt課件(參考版)
2025-05-05 12:02本頁面
【正文】 酶的作用 ： AP的顯色反應底物 (4) 單鏈探針的獲取 f1ori lacZ’ PT7 MCS pBluescript PT3 2958 bp Apr 探針的純化 G50 柱層析法 蛋白質 /DNA、蛋白質 /RNA雜交技術 四 DNA與蛋白質相互作用的方法 。 地高辛抗體 與 地高辛結合 。 地高辛抗體與 酶 偶聯。 ? 利用抗地高辛的抗體通過酶聯免疫反應來完成。 要求在專門實驗室操作。 （ 2）探針的標記： i） 標記物 同位素標記： 32P、 35S、 3H等 非同位素標記：生物素、地高辛、熒光素等 ii）標記方法 a 均勻標記 b末端標記 帶有放射性的已知序列的核酸片斷 標記 已知序列的核酸片斷 5’ 標記 已知序列的核酸片斷 3’ a 切口平移法 (nick translation)：大腸桿菌的 DNA聚合酶Ⅰ b 隨機引物法 (random primer)：六核苷酸殘基的引物 c PCR擴增標記法 : d末端標記法 : 5ˊ 3ˊ 3ˊ 5ˊ 5ˊ 3ˊ 5ˊ 3ˊ 5ˊ 5ˊ PCR擴增法標記示意圖 T4多核苷酸磷酸激酶（ T4PNP） T4PNP的基本特性：在 DNA、 RNA、 dNR、 NR的 5ˊOH上加磷 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4PNP Mg2+ pppATP（ g32PATP 3 ˊ HO p 5 ˊ 5 ˊ p HO 3 ˊ a. 放射性標記的 優(yōu)缺點： 制作簡單、 高比放射性、 放射自顯影效果好。 ? （ 1）探針的種類： ? 根據探針的標記物不同：放射性探針和非放射性探針； ? 根據探針的來源及核酸性質不同：分為 DNA探針，RNA探針， cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。 液相雜交 待測核酸分子與探針在雜交液中進行反應，分離雜交雙鏈和單鏈 RNA，再進行檢測。 CGH主要用于檢測腫瘤組織 DNA拷貝數變化（缺失、復制、擴增），并能將這些異常在染色體上定位。 (multicolor FISH。 檢測重組體克隆的菌落雜交技術 核酸原位雜交 (in situ hybridization) ：將標記的探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交檢測的方法。 菌落雜交 也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的 DNA同濾膜原位結合，帶有 DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標記特異的 DNA或 RNA探針雜交。這兩項技術更適應與核酸樣品的定量檢測。 斑點印跡雜交和狹線印跡雜交 斑點印跡雜交（ dot blotting）和狹線印跡雜交（ slot blotting ）是在 Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的量種類式的快速檢測特定核酸（ DNA和 RNA）分子的核酸雜交技術。 3) 電泳后的處理不同， RNA在電泳后可直接轉移到固相支持物上， DNA在電泳后需要經過堿變性處理及相應的中和處理。 1) 轉移的對象不同， Northern印跡轉移的是 RNA， Southern印跡轉移的是 DNA。由于這種方法與薩瑟恩 DNA印跡雜交技術十分類似，所以叫做諾賽恩 RNA印跡技術（ Northern blotting）。 在進行核酸印跡轉移的時， 1. 要將以轉好的硝酸纖維素膜在 80度下烘烤 1～ 2小時； 2. 紫外線交聯法，將 DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團之間進行交聯。 （ a） （ b） （ c） （ d） （ e） 基因組 DNA DNA限制片段 硝酸纖維素濾膜 同探針同源雜交的基因 DNA片段 X光底片 Southern 凝膠轉移雜交技術 雜交步驟： 電轉印法 Southern DNA 印跡雜交之 X光顯像圖片 水稻（ Oryza sativa L.)的葉綠體 DNA分別用核酸內切限制酶 BglⅡ(A C)、 BamHⅠ （ DF）、 EcoRⅠ （ GI）、和 HindⅢ （ JL）消化，加樣在含有 EtBr染料的 1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同 32P標記的玉米 psbA探針作 Southern雜交。 ?薩瑟恩 DNA印跡雜交 ? 根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過同標記的單鏈 DNA或 RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的 DNA片段，這種實驗方法叫做 DNA印跡雜交技術。 ? 尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟： ? 1. 核酸印跡轉移：將核酸樣品轉移到固體支持膜上。 ? 應用 1mol/L醋酸銨和 代替 SSC緩沖液可改善對小片斷 DNA的滯留能力。 ? DNA/DNA的雜交作用 檢測特定生物有機體之間的親源關系 ? DND/DNA或 RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。 ? 探針 Hybridization of Nucleic Acids RNA DNA1 DNA2 DNA Southern hybridization Northern hybridization Juang RH (2022) BCbasics 探針 DNA變性與復性 ①定義：氫鍵斷裂，單鏈 ②方法 :熱變性 : 90~100℃ 熔解溫度(Tm) 酸堿變性 :常采用
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