實驗一二重組質(zhì)粒dna提取、雙酶切鑒定、凝膠電泳、紫外分光法(已修改)
2025-06-07 07:01 本頁面
【正文】 質(zhì)粒 DNA的提取、純化、酶切、電泳、 紫外分光光度法定量測定 朱文博 中山醫(yī)學(xué)院 ?基因克隆示意圖 載體 D N A(限制性內(nèi)切酶切開 ) 目的基因＋宿主細胞＋ 重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細胞陽性克隆株繁殖表達分、切 接 轉(zhuǎn) 篩 基因工程 ?定義： 實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為重組 DNA技術(shù)，又稱重組 DNA技術(shù)。 基因載體 基因工程中常用的載體 (vector)主要包括質(zhì)粒 (plasmid)、 噬菌體 (phage)和 病毒 (virus)柯斯質(zhì)粒 。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點等。 實驗內(nèi)容 (P83) :DNA的瓊脂糖凝膠電泳 (P28) ： DNA的紫外分光光度法測定 (P37) DNA的提取與純化 (P70堿法 ) 實驗?zāi)康? ?掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用 。 ?掌握 核酸內(nèi)切酶切割 質(zhì)粒的原理并 學(xué)會運用內(nèi)切酶 ?掌握 DNA的瓊脂糖凝膠電泳的原理和步驟； ?掌握紫外分光光度計對 DNA含量的測定方法 。 一 .質(zhì)粒 DNA的提取 1 關(guān)于質(zhì)粒的概念 （ plasmid）？ ？ ？ ？ ？ 7 質(zhì)粒的定義 質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)一種自我復(fù)制的 環(huán)狀雙鏈 DNA分子 ，能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。 在細胞內(nèi)它們常以共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。 8 (1) 超螺旋 DNA (supercoiled DNA, SC DNA) 質(zhì)粒的三種構(gòu)型 9 (2) 開環(huán) DNA (open circular DNA, OC DNA) 如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就能發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。 10 (3) 線狀 DNA (linear DNA, L DNA): 如果兩條鏈均斷開，即為線狀 DNA。 電泳時，三者泳動速度大小關(guān)系（？？？） 11 最快 中 最慢 質(zhì)粒 DNA的一般特性： (1) 質(zhì)粒是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子 ,有 相對獨立性 。 (2) 它能在細菌中垂直遺傳并賦予宿主細胞一些 表型 ：菌毛、抗藥性等 (3) 它是 雙鏈閉合環(huán)狀 DNA，分子量大小不等。 (4) 質(zhì)粒 DNA與宿主菌染色體 DNA的兩點不同： ★ 宿主菌染色體 DNA通常比質(zhì)粒 DNA要大得多 ★ 純化分離的宿主菌 DNA多為線性分子，而質(zhì)粒 DNA呈閉合環(huán)的形式。 13 提取質(zhì)粒 DNA的目的與意義： 基因載體 /基因克隆 /基因工程 提取質(zhì)粒 DNA的常規(guī)方法 (1)SDS堿裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。 但原理相似，都是利用宿主染色體 DNA和質(zhì)粒DNA的差異來分離的。 2 提取大腸桿菌質(zhì)粒 DNA的 方法和原則 分離純化質(zhì)粒 DNA的主要步驟 (1)培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增 （ DNA的擴增與選擇 ） (2)細菌的收集與裂解 ? 收集方法：高速離心的方法 ? 裂解細菌方法：去污劑法、有機溶劑法、 堿變性法 、 沸水 熱裂法、溶菌酶法、超聲處理法等。 根據(jù)質(zhì)粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的
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