實(shí)驗(yàn)一二重組質(zhì)粒dna提取、雙酶切鑒定、凝膠電泳、紫外分光法-wenkub.com
2025-05-23 07:01 本頁面
【正文】 缺點(diǎn)：有一定的誤差（原因）；受蛋白類物質(zhì)干擾。 51 吸收池 或稱比色杯、比色皿、比色池，是用來盛裝被測溶液和決定透光液層厚度的器件。 47 特點(diǎn) ①靈敏度高：測定下限可達(dá) 10－ 5～ 10－ 6mol/L ② 準(zhǔn)確度高：能夠滿足微量組分的測定要求，相對誤差 2～ 5％（ 1～ 2％） 。 膠孔與電極成水平狀態(tài)，防止樣品跑歪。如果是有特殊要求，例如回收，強(qiáng)烈建議每點(diǎn)一個(gè)樣換一次槍頭。 沿著膠孔的邊緣勻速加入。暫時(shí)不用的膠最好放入電泳槽電泳液中浸泡。 30分鐘 過程中不要碰到梳子，盡量保持膠的位置不移動(dòng)。 EB如果在制膠時(shí)加入，在 60度左右時(shí)加入，使終濃度為 。梳子最好是預(yù)先放好并固定的，注意梳孔的體積能點(diǎn)的下所有的樣。 非常熱，小心燙手，另外注意不要加熱過度使膠沖出瓶子。 ，根據(jù)情況更換 buffer 排除電泳槽的電極接觸不良，確保buffer的緩沖能力，減少污染。 31 實(shí)驗(yàn)步驟 (1)建立反應(yīng)體系 (2)酶切反應(yīng)（溫育 12h） (3)電泳鑒定 32 雙酶切體系 質(zhì)粒 DNA 10μl 10 M buffer 2μl BamHⅠ 1μl HindⅢ 1μl ddH2O 6μl 33 合計(jì) 20μl 準(zhǔn)備室老師已加好 同學(xué)自己加 37 ℃ ， 12h 思考題？ ?為什么要對重組質(zhì)粒 DNA進(jìn)行雙酶切？ 34 1 原理 在 （堿性）的環(huán)境中 DNA的磷酸基團(tuán)解離，使 DNA在該環(huán)境中帶負(fù)電荷，在電場中向正極方向泳動(dòng)，因?yàn)楦鞣N DNA分子的電荷數(shù)、分子量、構(gòu)象不同，它們在通過凝膠立體網(wǎng)格時(shí)所受的動(dòng)力和阻力不同，所以泳動(dòng)的速度有差異，以此達(dá)到分離的目的。T T C G A A539。C T T A A G539。 25 作用 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng) ， 限制外源 DNA， 保護(hù)自身 DNA。l 冰 溶液 III，溫和振蕩 10s，冰浴 5min， 12022g 5min 轉(zhuǎn)移上清到新 EP管，加入等體積 酚 /氯仿 (1:1)，溫和振蕩，冰浴 3min，12022g 5min 上層水相轉(zhuǎn)移到新 EP管 ，加入 2倍體積 無水乙醇 ，顛倒混勻， 20 ℃ 冰箱中放置 15min， 12022g?10min 棄上清，沉淀中加 1ml 70%乙醇 ， 12022g 5min 去上清，管平放室溫靜置 10min， 20 181。 ② KAC會與 SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成 沉淀而除去；溶液中的 DNA也會與蛋白質(zhì) SDS 復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒 DNA分離。 核酸分離純化的總原則： ? (1) 保證核酸一級結(jié)構(gòu)完整 ? (2) 排除其他分子的污染（蛋白質(zhì)、脂類、 糖、 有機(jī)溶劑、金屬離子、其他 DNA、 RNA等） 3. SDS堿裂解法提取 Puc119U6重組質(zhì)粒DNA 實(shí)驗(yàn)原理： 高堿 細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)
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