凝膠電泳ppt課件(2)-wenkub.com
2025-04-29 12:02 本頁(yè)面
【正文】 偶聯(lián)酶及其底物 酶： 堿性磷酸酶 （ Alkaline Phosphatase, AP） 催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過(guò)程生成 有色的產(chǎn)物 。 探針檢測(cè)原理 地高辛 探針序列 待測(cè)基因 地高辛抗體 酶 底物 產(chǎn)物 探針 DNA用 地高辛 標(biāo)記。 優(yōu)點(diǎn)： 缺點(diǎn)： 半衰期短（ 32P只有 ）、 不易保存、 對(duì)人體有害。 RNA酶保護(hù)分析法 核酸酶 S1保護(hù)分析法 探針及探針的標(biāo)記 ? 探針：分子雜交中 被標(biāo)記 的 已知序列 的核酸片斷稱(chēng)為探針。 mFISH ) (Comparative Genomic Hybridization； CGH ) 由原位雜交發(fā)展起的一些新技術(shù) (Comparative Genomic Hybridization； CGH ) 利用 兩種 不同的 熒 光分別 標(biāo)記兩種 不同細(xì)胞的Genomic DNA ，再同 時(shí)與 正常的染色 體進(jìn) 行hybridization，染色 體 上不同 熒 光 間 的 強(qiáng) 弱比值，由 此 比 較 而 觀察 基因 組 中特定基因的拷 貝數(shù)變化 。 鑒定重組子。由于在實(shí)驗(yàn)的加樣過(guò)程中使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，使眾多待測(cè)樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。 2) 電泳前的處理不同， RNA在電泳前需要甲醛變性處理， DNA在電泳前不必變性處理。 諾賽恩 RNA印跡技術(shù)（ Northern blotting） 1979年， ，是將 RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于它是由 1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，故又叫 Southern DNA 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。 ? RNA變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。尿素、甲醛等 (退火 ) DNA/DNA， DNA/RNA， RNA/RNA 分子雜交的基本方法 ? Southern 印跡法 ? Northern 印跡法 ? 斑點(diǎn)印跡雜交 ? 原位雜交 ? Western 印跡法 ? 液相雜交 固相雜交 ? 雜種核酸分子： ? 彼此退火的核酸來(lái)自不同的生物有機(jī)體，而形成的雙鏈分子。 Western雜交： 即利用抗原 抗體反應(yīng) ， 檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 膜上的特異性蛋白質(zhì) 。 ? 分類(lèi)：根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同可分為 Southern雜交、 Northern雜交、 Western雜交。 二、 基因擴(kuò)增 （ gene amplification） ? 主要內(nèi)容： ? ? ，將目的基因在宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增 ? ，生物體內(nèi)相關(guān)保衛(wèi)基因的擴(kuò)增。 差別：有無(wú)變性劑 用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程中 ， 可直接用于酶促反應(yīng) （ 顏色變化 ） SDSPAGE可用于蛋白質(zhì)分子量 、 亞基組成的測(cè)定 。 1. 乙二醛 /二甲基亞砜法 原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥(niǎo)苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止 GC堿基的互補(bǔ)作用發(fā)生 步驟： RNA+10mM羥甲基醛和 50% DMSO混合 50℃ 、 1 h變性 點(diǎn)樣 電泳 染色 觀察 2. 羥甲基汞法 原理：羥甲基汞可與 RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。 4) 環(huán)狀 dsDNA電泳 : 常用于質(zhì)粒 DNA的初步鑒定 5) 線狀 ssDNA電泳 鏈分離凝膠 ：化學(xué)定序時(shí)，用于單鏈分離。 豎式 /聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍 。 3 電場(chǎng)夾角： 電場(chǎng)方向的夾角常為 1100 1200，研究證實(shí) 900夾角也非常有效的。常規(guī)方法制備 DNA 程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而樣 品增加， 制備 DNA樣品與常規(guī)方法 不同 脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（ PFGE） ?由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場(chǎng)方向、電流大小、以及作用時(shí)間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時(shí)調(diào)整其泳動(dòng)的方向，來(lái)適應(yīng)凝膠孔隙的無(wú)規(guī)則變化。 ?在脈沖電泳中，電場(chǎng)方向是周期變化的，頭一個(gè)脈沖電場(chǎng)方向與核酸的移動(dòng)方向成 45 度角，下一個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)成 45 度角。 垂直板電泳裝置 加樣 樣品遷移方向 電泳過(guò)程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。 Home 圖 .1 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖 .2 凝膠模示意圖 ? SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE）的原理 ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。 2 非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于雙鏈 DNA片段的分離和純化。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?Polyacrylamide Gel Electrophoresis ， PAGE 原理 ? 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺 (acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng) Acr)和交聯(lián)劑 N,N甲叉雙丙烯酰胺 (N,Nmethylenebisacylamide，簡(jiǎn)稱(chēng) Bis)在加速劑 N， N，N?， N?— 四甲基乙二胺 (N， N， N?， N?tetramethyl ethylenedia mine，簡(jiǎn)稱(chēng) TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡(jiǎn)稱(chēng) AP)或核黃素 (
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1