實驗一二重組質(zhì)粒dna提取、雙酶切鑒定、凝膠電泳、紫外分光法(編輯修改稿)
2025-06-22 07:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 、吸取酚時槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到 皮膚； 每人最終得到 20ul質(zhì)粒 DNA，其中 10ul用于酶 切和電泳，其余 10ul用于下次的轉(zhuǎn)化實驗，切 記！?。? 二、限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒 1 關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶 （ restriction endonuclease） 定義 能在特異位點（酶切位點）上催化雙鏈 DNA分子的斷裂 ,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性 DNA片段。 主要存在于細(xì)菌體內(nèi)。 切割不同來源的 DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價值（ “ 分子手術(shù)刀 ” ）。 25 作用 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng) ， 限制外源 DNA， 保護(hù)自身 DNA。 分類 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ （基因工程技術(shù)中常用 Ⅱ 型） 第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名 ， 用大寫； 第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 命名 Hin dⅢ 屬 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌 d株的第三種酶 2 BamHI 、 HindⅢ 酶切質(zhì)粒及鑒定 實驗原理： 利用限制性內(nèi)切酶特異的識別 DNA特異的核苷酸序列，并切割 DNA,產(chǎn)生一定長度的 DNA片段，通過電泳對酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因（重組質(zhì)粒 DNA） 28 重組質(zhì)粒 BamHI Hind III 雙酶切 電泳檢測 539。G A A T T C3‘ 339。C T T A A G539。 BamHI 539。A A G C T T339。 339。T T C G A A539。 Hind III PUC119（ ） U6啟動子（ 256bp） 實驗材料 : (1)重組質(zhì)粒 。 (2)BamHI 、 Hind Ⅲ 限制性內(nèi)切酶 。 (3)反應(yīng)緩沖液。 31 實驗步驟 (1)建立反應(yīng)體系 (2)酶切反應(yīng)（溫育 12h） (3)電泳鑒定 32 雙酶切體系 質(zhì)粒 DNA 10μl 10 M buffer 2μl BamHⅠ 1μl HindⅢ 1μl ddH2O 6μl 33 合計 20μl 準(zhǔn)備室老師已加好 同學(xué)自己加 37 ℃ ， 12h 思考題？ ?為什么要對重組質(zhì)粒 DNA進(jìn)行雙酶切？ 34 1 原理 在 （堿性）的環(huán)境中 DNA的磷酸基團解離，使 DNA在該環(huán)境中帶負(fù)電荷，在電場中向正極方向泳動，因為各種 DNA分子的電荷數(shù)、分子量、構(gòu)象不同，它們在通過凝膠立體網(wǎng)格時所受的動力和阻力不同，所以泳動的速度有差異，以此達(dá)到分離的目的。
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