dna--重組-酶切和連接(編輯修改稿)
2025-02-01 02:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 AKP () pETBlue2 轉(zhuǎn)化 復(fù)蘇 pETBlueAKP － AKP pETBluepETBlue AKP √ ? 酶切： 370C，水浴酶切 3小時 (封口膜封口） ? 酶切產(chǎn)物的純化和盒回收： 直接進行液體回收： 每 100uL溶液加入 500uL溶膠液，其余的操作步驟同前。 向柱子的 正中央 共 加 20uL洗脫 buffer，其余步驟同前。 酶 切 反 應(yīng) 體 系 管號 核酸 10xbufferK ddH2O BamHI HandIII tube1 目的基因 AKP 24 uL 3 uL 0 uL 2 uL 1 uL tube2 pETBlue2 10 uL 2 uL 5 uL 2 uL 1 uL 實驗操作－酶切 每人做一至兩份 膠回收原理 硅基質(zhì)材料： 小片段雙鏈 DNA高鹽環(huán)境與其吸附 低鹽環(huán)境與其解離 1. 每 100uL溶液加入 500uL溶膠液 ,混勻。 2. 將液體轉(zhuǎn)移至吸附柱， 12022rpm離心 30秒，去除廢液 3. 漂洗 :向吸附柱的 正中央 加入 500uL漂洗液， 12022rpm離心 30秒，去除廢液。 重復(fù)一次。 4. 空柱 12022rpm離心 2min，以徹底去除廢液 5. 將吸附柱置于一新的干凈 無菌的 ，向吸附柱的 正中央 加 15uL無菌水，室溫放置 5分鐘。 12022rpm離心 30秒，以洗脫 DNA。 6. 再次向柱子的 正中央 加 5uL無菌水，室溫放置 5分鐘； 12022rpm離心 2分鐘。 合并回收液 。 7. SYBR檢測回收產(chǎn)物 避免乙醇對酶促反應(yīng)的影響 1%瓊脂糖凝膠 25mL (用 1xTAE配 ) 1uL GoldView 樣品：酶切 DNA 4uL + 10xloading 質(zhì)粒對照：未酶切質(zhì)粒 DNA 2uL + 10xloading 分子量 Marker： 5uL
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