dna重組及重組dna技術(shù)(編輯修改稿)
2025-01-26 01:52 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 作高比活探針； ③ DNA序列分析； ④ 填補(bǔ) 3?末端 Klenow片段 又名 DNA聚合酶 I大片段，具有完整 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合、 3??5?外切活性，而無(wú) 5??3?外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈 DNA 3?末端標(biāo)記等 反轉(zhuǎn)錄酶 ① 合成 cDNA； ② 替代 DNA聚合酶 I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5?羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶 在 3?羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 目錄 限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease) 限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE)是一類核酸內(nèi)切酶 ， 能識(shí)別雙鏈 DNA分子內(nèi)部的特異序列 , 并裂解磷酸二酯鍵 。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ ? 定義： 目錄 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng) ， 限制外源 DNA， 保護(hù)自身 DNA。 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ （基因工程技術(shù)中常用 Ⅱ 型） ? 分類： ? 作用： 目錄 第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名 ， 用大寫(xiě)； 第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)； 第四個(gè)字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 ? 命名： Hin dⅢ 屬 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌 d株的第三種酶 目錄 Ⅱ 類酶識(shí)別序列特點(diǎn) —— 回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 切口 ： 平端切口 、 粘端切口 GGATCC CCTAGG 目錄 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 黏端切口 目錄 有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同 ， 但切割 DNA后 ， 產(chǎn)生相同的粘性末端 ，稱為同尾酶 。 這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍末端 (patible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A ? 同尾酶 目錄 來(lái)源不同的限制酶 ， 但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn) ， 這些酶稱 同裂酶或同功異源酶 。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ ?同裂酶： 名 稱 識(shí)別序列及切割位點(diǎn) 名 稱 識(shí)別序列及切割點(diǎn) 切割后產(chǎn)生５ ’突出末端 : BamHⅠ 5’… G▼GATCC...3’ Bgl Ⅱ 5’… A▼GATCT...3’ EcoR Ⅰ 5’… G▼AATTC...3’ Hind Ⅲ 5’… A▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’… C▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’… ▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’… GA▼TATG...3’ 切割后產(chǎn)生 3’突出末端 : Apa Ⅰ 5’… GGGCC▼C...3’ Hae Ⅱ 5’… PuGCGC▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’… GGTAC▼C...3’ Pst Ⅰ 5’… CTGCA▼G...3’ Sph Ⅰ 5’… GCATG▼C...3’ 切割后產(chǎn)生平末端 : Alu Ⅰ 5’… AG▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’… GAT▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’… GG▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’… CAG▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’… CCC▼GGG...3’ 限制性內(nèi)切核酸酶 目錄 二、重組 DNA技術(shù)中常用的載體 ? 定義 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。 ? 載體按功能分為 克隆載體 (cloning vector) 表達(dá)載體 (expression vector) 目錄 ?克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源 DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為 克隆載體 。 ?表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為 表達(dá)載體 。 目錄 （一）克隆載體 ? 至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行 自主復(fù)制 ，并能使克隆的外源 DNA片段得到同步擴(kuò)增； ? 至少有 一個(gè)選擇標(biāo)志 （ selection marker） ：選擇標(biāo)志是區(qū)分含與不含載體的細(xì)胞所必需的 ， 包括抗生素抗性基因 、 β半乳糖苷酶基因 （ lacZ） 、 營(yíng)養(yǎng)缺陷耐受基因等 。 ? 有適宜的 RE的單一切點(diǎn) ：載體中一般都構(gòu)建有一段特異性核苷酸序列 ， 在這段序列中包含了多個(gè) RE的單一切點(diǎn) ，可供外源基因插入時(shí)選擇 ， 叫多克隆位點(diǎn) （ multiple cloning sites， MCS） 。 1. 克隆載體應(yīng)具備的基本特點(diǎn) 目錄 （ 1）質(zhì)粒 (plasmid) 特點(diǎn) : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息 , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀 。 2. 常用的克隆載體 pUC18質(zhì)粒載體圖譜 目錄 ? λ噬菌體 DNA改造系統(tǒng) λgt系列（插入型，適用 cDNA克?。? EMBL系列（置換型，適用基因組克?。? （ 2）噬菌體 (phage) ? M1
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