重組dna技術1(編輯修改稿)
2024-12-23 23:21 本頁面
【文章內容簡介】 質粒載體 的一般結構 DNA克隆常用載體 ? 基因克隆獲得大量目的基因后 ， 就要使其在合適的宿主細胞 中表達 ， 產生需要的基因表達產物或使宿主生物具備所需的性狀 ， 同時目的基因還能在宿主細胞中穩(wěn)定遺傳 。 這一過程就是 遺傳轉化 。 ? 若需要讓克隆的基因表達和產生大量編碼蛋白 ， 可對轉化的大腸桿菌進行培養(yǎng)使目的基因大量表達和積累 。 對表達產物分離純化便可獲得想要的產品 。 ? 通過 DNA體外重組技術構建的重組質粒還可以直接用以轉化藍藻等原核生物或其他一些原生生物 。 轉化受體細胞和轉化子的篩選 宿主菌或受體細胞 ? 大腸桿菌 ? 酵母 ? 昆蟲細胞 ? 哺乳動物細胞 ? 感受態(tài)細胞（ petent cell） 受體細胞和重組基因的導入 （ 轉化或轉染 ） ? 將目的基因克隆到 大腸桿菌細胞 中的操作步驟： 1． 獲得目的基因和質粒載體； 2． 形成重組質粒； 3． 制備感受態(tài)細胞 ， 用重組質粒轉化大腸桿菌細胞； 4． 培養(yǎng)大腸桿菌 ， 讓重組質粒及外源目的基因形成大量拷貝； 5． 篩選含重組質粒的大腸桿菌細胞 ， 進行檢查或鑒定 。 pUC118質粒的 多克隆位點整合在 lacZ基因中 ， 該位點如果沒有插入外源目的基因 ， lacZ基因便可表達出 ?半乳糖苷酶 ， 如果平板培養(yǎng)基中含有 IPTG（ 乳糖操縱子 的 誘 導物 ） 和 Xgal， Xgal（ ?半乳糖苷酶的底物 ） 便會被 ?半乳糖苷酶水解成蘭色 ， 大腸桿菌形成 藍色克隆 。 在多克隆位點插入外源目的基因，破壞了 lacZ基因的結構，大腸桿菌形成 白色的克隆 利用 lacZ基因的插入失活 篩選重組質粒 篩選克隆 pUC18載體還攜帶了 抗生素 （ antibiotic） 基因 ， 可 篩選重組質粒 。 ? 一般克隆基因的檢查和鑒定方法 ? 瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段： 磷酸基團帶負電荷 酶解片段 向陽極移動 電場驅動力和凝膠阻力 ——不同遷移率 分子量標準參照物 ? 酶切和電泳方法 Restriction mapping 酶切 克隆基因的檢查和鑒定方法 ? 32P標記的 DNA分子探針 ? 雜交 ? 放射自顯影法 ? DNA雜交直接鑒定 ? 植物遺傳轉化常用的方法 ? 載體法轉化 —— 農桿菌介導法 （ Ti質粒 ） ? 基因的直接轉移 （ 1） 高壓電脈沖電激穿孔 （ 2） 基因槍法 （ 3） 微注射法 ? 構建缺失 chlL基因的藍細菌突變株 （ 直接轉化重組質粒 ） ? 紀念發(fā)明者 Edward Southern （ 1） 提取總 DNA （ 2） 酶解 （ 3） 電泳 （ 4
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