dna體外重組技術(shù)介紹(編輯修改稿)
2025-01-26 01:51 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 外切酶活性 )二、 DNA聚合酶 I? PCR反應(yīng) 主要用途? DNA測序用途：3. Taq DNA聚合酶 (65kD)耐熱， 在 70～ 75℃ 時具有最佳的生物活性， 無 3′→ 5′ 外切酶活性 (無校正功能）(Reverse Transcriptase, RT)功能： 以 RNA為模板，以帶 3′OH末端的DNA片段為 引物 ， 沿 5′至 3′方向合成DNA鏈。3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′dNTPMg2+ 反轉(zhuǎn)錄酶3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′5′TTTTTTT—OH 3′AGACAGGAT……3′1. RNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶活性5′TTTTTTT2. DNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶活性；RNA酶 H(3′→5′RNA 外切酶 )活性 .4. 反轉(zhuǎn)錄酶功能：后者可降解 DNARNA雜交分子中的 RNA反轉(zhuǎn)錄酶 缺乏 3′→5′ 核酸外切酶 活性 ,故未校正功能 , 會出現(xiàn)錯配 .應(yīng)用最主要是將 mRNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA三、 DNA連接酶 (DNA ligase) —— 基因工程的 縫紉針 催化雙鏈 DNA相鄰堿基 5′P和 3′OH間 磷酸二酯鍵 形成的酶。T4噬菌體 DNA連接酶 最常用 ① 催化兩個獨立 DNA片段 (粘性末端和平末端) 5′P和 3′OH之間形成 磷酸二酯鍵 。主要功能與用途：催化 平末端 連接要比 粘性末端 效率低得多。② 修復(fù)雙鏈 DNA分子中單鏈缺口。三、 DNA連接酶 (DNA ligase) 修復(fù)雙鏈 DNA分子中單鏈缺口 ,并可催化互補(bǔ)粘性末端的連接 .主要用于 cDNA第二鏈的合成 .主要功能與用途：(二 ) 大腸桿菌 DNA連接酶 連接粘性末端可代替 T4 DNA連接酶 .四、其他修飾酶功能： 催化多個 脫氧 核苷酸 依次加到 單鏈或 雙鏈 DNA分子的 3′OH末端。(一 ) 末端 脫氧核苷酸 轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 用途： 1. 主要作用是在載體或目的基因 3′末端加上同源 多聚尾巴 ，形成 人工粘性末端 ，便于 DNA重組。2. DNA 3′末端的 同位素標(biāo)記 。催化 DNA， RNA以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的 5′ 磷酸基團(tuán)水解 。用途：1. 在連接反應(yīng)中去除載體 DNA片段 5′P，防止載體自我連接 .2. 用 32P標(biāo)記 5′末端時，用此酶去除 5′P，再用激酶進(jìn)行 5′的 32P標(biāo)記 .(二 ) 堿性磷酸酶功能：(三 ) 多聚核苷酸激酶(四 ) RNase(五 ) DNase第三節(jié)目的基因的獲得和修飾分? 通過基因組文庫分離、篩選基因? 通過 cDNA文庫分離、篩選基因? 應(yīng)用 PCR或 RTPCR獲得目的基因? 人工合成基因一、 采用限制性內(nèi)切酶酶切法直接分離目的基因1. 從原核基因組中制備2. 從真核基因組中制備二、 采用 PCR或 RTPCR方法制備目的基因1. 獲得已知的基因2. 構(gòu)建 RTPCR文庫法并獲得未知基因3. 計算機(jī)克隆三、 基因組文庫或 cDNA文庫的構(gòu)建和篩選 基因組文庫 (genomic library， G文庫 )用基因克隆的方法保存宿主細(xì)胞中的 DNA重組分子中的集合 , 所有重組子所含的插入片段的總和代表某種生物基因組全部核苷酸序列。分離、篩選基因方法 ： 分子雜交及探針技術(shù) 用目的基因上的一段 DNA做成 探針 與文庫中的 DNA作 核酸雜交 ，從基因文庫中“釣出 ”有目的基因的克隆。G文庫構(gòu)建方法 ： 鳥槍法 cDNA文庫 (cDNA library， C文庫 )用基因克隆的方法保存在宿主細(xì)胞中的 DNA重組體的群體，每一重組子只含一種 mRNA信息，這些重組子的總和包含某種生物的全部 mRNA序列。C文庫構(gòu)建方法 ： 反轉(zhuǎn)錄法合成的 cDNA與合適的載體重組并導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成的分離、篩選基因方法 ：分子雜交及探針技術(shù)C文庫的優(yōu)勢與局限性 本方法適用于氨基酸殘基數(shù)目較少的蛋白基因。缺點： 2. 如目的基因 DNA序列需 通過氨基酸序 列推測 ，難于保證與 天然基因 序列一 致，往往導(dǎo)致 表達(dá)效率大大
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