劉寧_dna重組技術(shù)的基本工具(編輯修改稿)
2025-02-26 09:11 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 部分基因文庫 （如 :cDNA文庫） 基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系 怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢 ? ? 目的基因的提取方法 直接分離基因 人工合成基因 反轉(zhuǎn)錄法 根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA ： 鳥槍法 鳥槍法： 供體細胞中的 DNA 許多 DNA片段 運載體 限制酶 與載體連接 載入 受體細胞 產(chǎn)生特定性狀 導(dǎo)入 外源 DNA擴增 目的基因 分離 (直接分離法 ) 直接分離基因 1）反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使 RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈 DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈 DNA，從而獲得所需的基因。 目的基因的 mRNA 單鏈 DNA(cDNA) 雙鏈 DNA (即目的基因 ) 反轉(zhuǎn)錄 合成 2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成 DNA法 ： 根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使 RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 推測 推測 目的基因 化學(xué)合成 ? 上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？ 優(yōu)點 缺點 鳥槍法 反轉(zhuǎn)錄法 根據(jù)已知氨基酸合成 DNA法 操作簡便廣泛使用 工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因 專一性強 操作過程麻煩， mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高 專一性最強 僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因 思考 :為什么要構(gòu)建基因文庫 ?直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎 ? ? 哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？ 1） DNA序列自動測序儀： 2） PCR技術(shù)： 對提取出來的基因進行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。 ① 概念： PCR全稱為 _______________，是一項 在生物 ____復(fù)制 ___________的核酸合成技術(shù) ③條件： _______________________、 _______________、 ___________ (做啟動子 )、 ： ②原理： __________ ④方式：以 _____方式擴增，即 ____（ n為擴增循 環(huán)的次數(shù)） ⑤結(jié)果： 選修 1 P60 聚合酶鏈式反應(yīng) 體外 特定 DNA片段 DNA復(fù)制 已知基因的核苷酸序列 四種脫氧核苷酸 一對引物 DNA聚合酶 指數(shù) 2n 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增 (二 )利用 PCR技術(shù)擴增目的基因 _________切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出 ____________。 _____________切斷目 的基因，使其產(chǎn)生 _____ ____________。 (二 )基因表達載體的構(gòu)建 —— 核心 ______處， 再加入適量 ___________，形成了一個重組 DNA分子（重組質(zhì)粒） 限制酶 黏性末端 同一種限制酶 的黏性末端 切口 DNA連接酶 相同 質(zhì)粒 DNA分子 限制酶處理 一個切口 兩個黏性末端 兩個切口 獲得目的基因 DNA連接酶 重組 DNA分子（重組質(zhì)粒） —— 核心 同一種 (二 )基因表達載體的構(gòu)建 : ： 復(fù)制原點 +目的基因 +啟動子 +終止子 +標記基因 它們有什么作用？ ? 常用的受體細胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。 ? 將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理 借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。 步驟三：目的基因?qū)胧荏w細胞 (三 )將目的基因?qū)胧荏w細胞 轉(zhuǎn)化 —— 方法 將目的基因?qū)? 植物細胞 將目的基因?qū)? 動物細胞 將目的基因?qū)? 微生物細胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 —— 顯微注射法 —— 感受態(tài)細胞 目的基因進入 _________內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持 _____和 _____的過程 受體細胞 穩(wěn)定 表達 將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ恨r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 （ 1）農(nóng)桿菌介紹 （ 2）原理及適用范圍 (三 )將目的基因?qū)胧荏w細胞 將目的基因?qū)雱游锛毎? （ 1）方法：顯微注射法 （ 2）程序： (三 )將目的基因?qū)胧荏w細胞 將目的基因?qū)胛⑸锛毎? （ 1）思考：
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