重組dna-分子克隆技術(shù)(編輯修改稿)
2025-02-17 16:12 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 外源基因在很短時(shí)間 (通常在接種后 1~2 周內(nèi) )可達(dá)最大量的積累； ※ 病毒基因組小 , 易于進(jìn)行遺傳操作 , 大多植物病毒可以通過(guò)機(jī)械接種感染植物 , 適于大規(guī)模商業(yè)操作 。 ※ 宿主范圍廣 , 一些病毒載體能侵染農(nóng)桿菌不能或很難轉(zhuǎn)化的單子葉、豆科和多年生木本植物 , 擴(kuò)大了基因工程的宿主范圍 。 ※ 病毒顆粒易于純化 , 可顯著降低下游生產(chǎn)成本。所以植物病毒是外源基因的瞬時(shí)高效表達(dá)載體。 ? 第 3步：外源基因與載體的連接 即 DNA的體外重組。這種 DNA重組是靠 DNA酶將外源 DNA與載體共價(jià)連接的。 1．粘性末端連接 (1)同一限制酶切割位點(diǎn)連接 由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同 DNA片段具有完全相同的末端。那么，當(dāng)這樣的兩個(gè) DNA片段一起退火時(shí)，粘性末端單鏈間進(jìn)行堿基配對(duì)，然后在 DNA連接酶催化作用下形成共價(jià)結(jié)合的重組 DNA分子。 (2)不同限制酶切割位點(diǎn)連接 由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的 DNA片段，具有相同類型的粘性末端，即配對(duì)末端 粘端連接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4DNA連接酶 HapⅡ 2．平端連接 ※ 限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生的平端 ※ 粘端經(jīng)特殊酶處理變?yōu)槠蕉? 平端連接 AGCT TCGA AluⅠ DNA連接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA AluⅠ 3．同聚物加尾連接 同聚物加連接是利用同聚物序列，如多聚 A與 多聚 T之間的退火作用完成連接。在末端轉(zhuǎn)移 酶作用下，在 DNA片段制造出粘性末端，而后 進(jìn)行粘性末端連接。 同聚物加尾連接 5’ 5’ 5’ 5’ AAA AAA TTT TTT TdT酶 連接酶 4．人工接頭連接 由平端加上帶有新的酶切位點(diǎn)的寡核苷 酸，再用限制酶切產(chǎn)生粘性末端，進(jìn)行 連接。 人工接頭連接 BamHI BamHI BamHI ? 第 4步：重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 根據(jù)重組 DNA時(shí)所采用的載體性質(zhì)不同，導(dǎo)入重組 DNA分子有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和感染等不同手段 。 。 經(jīng)一定方法處理 (如 CaCl2處理 )后具備接受外界 DNA能力的大腸桿菌。受體菌應(yīng)為安全無(wú)毒菌株，且為限制酶缺陷型及重組缺陷型。 、轉(zhuǎn)染及感染。 轉(zhuǎn)化： 以質(zhì)粒為載體，將攜帶外源基因的載 體 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染： 以噬菌體為載體，用 DNA連接酶使噬 菌體 DNA環(huán)化，再通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入受 體菌。 感染： 以噬菌體為載體，在體外將噬菌體 DNA包裝成病毒顆粒，使其感染受體菌。 50100mmol/L CaCl2 感受態(tài)細(xì)菌 重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌 轉(zhuǎn)化 ? 第 5步：重組體克隆的篩選和鑒定 1．直接選擇法 直接法是針對(duì)載體攜帶某種或某些標(biāo)志基因 和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法，其特點(diǎn)是直 接測(cè)定基因表型。 （ 1）抗藥性標(biāo)志選擇： 如果克隆載體攜帶有某 種抗藥性標(biāo)志基因，則只有含這種抗藥基因 的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌藥物的培養(yǎng)板 上幸存并形成菌落。 （ 2）標(biāo)志補(bǔ)救： 若克隆的基因能夠在宿主菌 表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷 互補(bǔ)，那么就可以
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