【文章內容簡介】 其與載體連接的是粘端； 與目的基因連接端則 “可平可粘” 美國康奈爾大學生化分子生物學系 吳瑞博士于 1978年發(fā)明。 連接子與普適子比較 3）連接方式 — 小結 (1) 匹配的粘端連接 全同源粘端的連接 多是單酶切后的連接 定向克隆 雙酶切 (2) 不匹配的粘端 變成平端，再連接 （ 3）平端連接 直接連接 同聚物加尾法 連接子（ linker) 、雙連接子（定向克?。? 普適子（ adaptor，套頭，適應子 ) **同聚物加尾法連接的產物及部分 T4連接酶直接連接平端 的產物無法用原來的 RE來實現(xiàn)特異性的切割和回收（插入片段） Why? 4）連接的條件 （ 1） 溫度和時間 ： 1216℃ ，連接 12l6h （ overnight） （ 2） 連接酶的濃度 ：平端連接用 12U，粘端連接用，即可達到最佳效率。實際應用時參照說明書（廠家不同，活性相差大）。 （ 3）插入片段與載體分子的 摩爾比值 為 23： 1 *1U的連接酶：在最佳反應條件下， 15℃ 反應 1小時， 完全連接 1μg λ DNA（ Hin DIII片段）所需要的酶量。 2 重組 DNA的基本步驟 21 目的基因的獲得 22 目的基因和載體的酶切 1）限制性內切酶 2）載體 3）酶切時酶的選擇 23 目的基因與載體的連接 24 重組子的轉化 25 重組子的篩選和鑒定 rDNA導入受體細胞 1）導入的目的 擴增外源基因 獲得其表達產物 rDNA導入宿主細胞，利用其生理條件，重組載體（如質粒）得以擴增，獲得足夠量的 rDNA拷貝 1分子 rDNA,1分子外源基因 2）受體細胞種類及基本特性 （ 1） 原核細胞 ：既可復制擴增、又可表達外源基因；最經典和最常用的受體細胞是 大腸桿菌 。 （ 2） 真核細胞 ：用于基因表達，如哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞。 （ 3） 基本特性 ① 易接納 rDNA ② 對載體復制擴增無嚴格限制 ③ 不降解 /不修飾外源 DNA分子 ④ 符合安全標準 3）外源基因導入的相關概念 ? 轉化 (transformation)： rDNA導入 原核細胞 （細菌等）的過程。 ? 感受態(tài)細胞 (Competent Cell)：經特殊處理后 易接受外源 DNA的受體細胞 細菌表面正電荷增加，細胞壁和膜的通透性增加，以利于DNA分子的吸附和吸收 。 轉染 (transfection): 將 rDNA導入真核細胞的過程。 感染 (infection)：通過攜帶 rDNA的病毒感染受體細胞， 從而把外源 DNA轉移到受體細胞的過程 。 4） 導入原核細胞的常用方法 （ 1）氯化鈣轉化法：最經典、應用最廣泛。 原理 ： 在 0℃ 、 2價陽離子的低滲溶液中，細菌膨脹成球形（感受態(tài)）；在 42 ℃ 的熱沖擊下重組子可進入細胞；在培養(yǎng)基上生長數(shù)小時，球形細胞恢復原狀并繁殖。 轉化率 ： 1056轉化子 /μ gDNA（ 轉化子：經過轉化獲得外源遺傳物質的細胞） 42 ℃ （ 2）電穿孔法 (electroperation) 電穿孔儀 原理 ： 隨著外加電場電壓升高，細胞膜被壓縮變??；當膜電壓升到一定數(shù)值時，膜被擊穿，形成微孔，外源基因由此 進入細胞質內；切斷電場后，被擊穿的膜孔可自行復原 優(yōu)點 ：轉化率高， 1089轉化子 /μ g DNA； 原核和真核細胞均可。 不足 ： 如電壓過大，致 不可逆的膜 損傷，細胞成活率低 大致參數(shù)：電壓： 300～ 600V；冰上操作 維持時間： 20～ 100ms 2 重組 DNA技術的基本步驟 21 目的基因的獲得 22 I和 V的酶切 1）限制酶 2）載體 3）酶的選擇 23 I與 V的連接 24 重組子的轉化 25 重組子的篩選和鑒定（ Why? How?) 轉入 13的受體細胞是否都可在含抗生素的培養(yǎng)皿中生長？ 為什么？ 如何分辨 “ 內涵不同 ” 的菌落？ 重組 DNA分子的篩選與鑒定 1）為什么要篩選和鑒定 （ 1） 重組率不可能達到 100% （ 2） 凡是轉入了載體的細胞都獲得了相應的抗生素抗性，都可以在平板上生長菌落，其中包括了轉入 空載體或反向插入或多拷貝插入 等的細胞。 （ 3） PCR擴增的插入片段，還需要鑒定序列的正確性。 因此，重組體的篩選和鑒定乃重組 DNA技術的重要步驟。 篩 /鑒 （ 1）插入失活篩選 （ 2）藍 /白色篩選 （ 3）限制酶切圖譜篩選 （ 4）原位雜交技術 （ 5）免疫學方法 （ 6） PCR篩選重組體 （ 7）核苷酸序列測定 2） 篩選和鑒定方法 3）抗生素抗性基因 插入失活法 最早、最廣泛使用的方法。 例如： pBR322質粒具有 Ampr和 Tetr 原理： 插入失活（或插入缺失） 在體外重組中， I插入 V的 Tetr基因序列中 ,致其失活；該重組子轉化的宿主細胞便不能在含 Tet的平板上生存。 操作程序： ?先將轉化液涂布含有 Amp的平板； ?再將 Amp平板上的 轉化子（菌落）影印至 同時 含有Amp和 Tet的平板上； ?結果判斷： 在 Amp平板上生長、但在Amp和 Tet平板上不長的轉化子即為 含重組子的菌落 。 4） α 互補篩選（ 藍 白 色菌落篩選） 原理： ? 載體中的 LacZ(N)是 DNA的短區(qū)段，編碼 β －半糖苷酶 N端的 146個 AA（也稱 α －多肽），其中的 Plac可以啟動LacZ的轉錄和表達，但受抑制； IPTG（異丙基硫代 β －半乳糖苷）能夠去抑制； ? 受體菌 JM103含 LacZ(C)，可編碼 β －半乳糖苷酶的 C端部分 ? α －互補 ：當該類載體轉入相應受體中， LacZ(N)與 LacZ(C)編碼的產物可以組合成具有活性的酶蛋白，使底物 Xgal分解生色（ 5溴 4氯 3吲哚 β －半乳糖苷），因此出現(xiàn) 藍 色菌落。 ? 當在 MCS內的 LacZ（ N)序列中插入外源基因后，該基因便 不能正常表達 ，因此也就 不能與受體菌實現(xiàn) α －互補 作用，所以菌落呈 白 色。 4）藍 白 色 篩選 原理示意圖 3）限制性酶切圖譜法 : 基本流程 （ 1）挑選平板上的菌落 → 小量培養(yǎng) → 快速提取質粒； （ 2） 酶切（ rDNA和載體）； （ 3）分析并比較凝膠電泳結果 :依據(jù) 插入片段的 有無 或 /和 重組子的 大小 即可判斷所選菌落是否含重組子。 （ 4）核酸雜交法 原理：利用標記（如 32P）的 DNA或 RNA探針，與轉化細胞的 DNA進行核酸雜交， 利用同源DNA配對的原理篩選含有目的基因的重組子。 關鍵：探針制備，其長度 100～ 1000bp。 標記物：放射性同位素、生物素等 方法： 菌落原位雜交和 Sblot 菌落原位雜交技術 5） PCR篩選 以重組 DNA為模板， PCR法直接擴增外源基因，電泳鑒定 /序列分析：是否有目的基因存在。 6）免疫反應篩選： 此法不是直接檢測（目的）基因，而是檢測該基因編碼的產物（利用抗原抗體反應），以此來篩選含有目的基因的轉化細胞。 7）核苷酸序列測定 經上述方法篩選的重組子，還需要通過測 DNA序列測定，此乃最后鑒定： *如是已知基因：確認 本次重組是否準確無誤，尤其插入片段來自 PCR時； *如是未知基因： 明確其結構，以推測其功能。 3 重組 DNA技術的進展 31 提高連接效率 32 TA克隆 33 TOPO系列連接方法 其它（略） 31 提高連接效率 NEB公司生產的 快速連接試劑盒 — T4 DNA連接酶 高達 2022U/ul，是其它產品的400倍 ，因此連接效率大為提高： overnight vs 5 min（ sticky or blunt ends） 32 TA克隆 直接 重組 PCR產物 的簡便方法。 原理： TaqDNA聚合酶 在擴增目的基因的同時，可以不依賴模板而在產物的兩端加上 游離的 A； 因此，只要在載體切口處加上 游離的 T，PCR產物就可在 T4 DNA連接酶催化下 直接與載體連接！ 該法已廣泛應用； 商品化的載體如pGEMT Taq 酶同時具有末端連接酶活性，會在每條產物的 3’ 端自動加上非模板依賴堿基 ,而且對 A優(yōu)先 , 所以， PCR產物末端的多余堿基大部分都是 A 33 TOPO系列連接方法 無需連接酶 * TOPO Cloning is a molecular biology technique in which DNA fragments amplified by either Taq or Pfu polymerases are cloned into specific vectors without the requirement for DNA ligases. * The key