dna重組技術的基本過程(編輯修改稿)
2025-01-26 01:54 本頁面
【文章內容簡介】 5’ CTGCA G G ACGTC 第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎（ 4）粘性末端的意義① 連接便利i）不同的 DNA雙鏈： 只要粘性末端堿基互補就可以連接，這比連接兩個平齊末端容易的多。ii）同一個 DNA分子內連接： 通過兩個相同的粘性末端可以連接成 環(huán)形分子 。② 5’末端標記： 凸出的 5’末端 可用 DNA多核苷酸激酶進行 32P標記。凸出的 3’端 可以通過末端轉移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如 AAA或 TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 補平成平齊末端： 粘性末端可以用 DNA聚合酶補平成平齊末端。第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎（ 5）同裂酶 （ Isoschizomers)： 識別位點的序列相同的限制性內切酶。 ① 完全同裂酶： 識別位點和切點完全相同。如 Hind Ⅲ 和 Hsu I。Hind Ⅲ 5’A?AGCTT3’ 3’TTCGA?A5’ Hsu I 5’A?AGCTT3’ 3’TTCGA?A5’ ② 不完全同裂酶： 識別位點相同，但切點不同。如 Xma I 和 Sma I。Xma I 5’C?CCGGG 3’ 3’GGGCC?C5’ Sma I 5’CCC?GGG3’ 3’GGG?CCC5’ 第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎（ 6）同尾酶 (Isocaudamers）： 識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、 Bgl Ⅱ 、 Bcl I、 Xho Ⅱ 等。 5’G?GATCC3’ 3’CCTAG?G5’ BamH IBcl I 5’T?GATCA3’ 3’ACTAG?T5’ 5’A?GATCT3’ 3’TCTAG?A5’ Bgl Ⅱ5’U?GATCY3’ 3’YCTAG?U5’ Xho ⅡU代表嘌呤； Y代表嘧啶。第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎5’?GATC3’ 3’CTAG?5’ Sau 3A 同尾酶的粘性末端互相結合后形成的新位點 一般不能再被原來的酶識別。 ？5’G 3’CCTAG GATCT3’ A5’ BamH I Bgl Ⅱ5’GGATCT3’ 3’CCTAGA5’ BamH I Bgl ⅡSau 3A（（ 7）限制酶的酶活性）限制酶的酶活性 ：： 限制性內切酶的識別和酶切活性一般在限制性內切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、一定的溫度、離子強度、 pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點的專一性。因此，點的專一性。因此， 一般使用專一的反應緩沖液一般使用專一的反應緩沖液 。 星號（ *）活性： 如果改變反應條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（ *）活性。 EcoR I和 BamH I等都有 *活性。第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎在低鹽、高 pH（ 8）時可識別和切割GAATTA、 AAATTC、 GAGTTC等EcoR I： GAATTC（ 8） Ⅱ s型限制性內切酶 移動切割（ shifted cleavage)： 在離它的 不對稱識別位點一側的 特定距離 處切割 DNA雙鏈。 長度為 47bp ，切割位點可能在識別位點一側的 20bp 范圍內。 GACGCNNNNN? Hga ICTGCGNNNNNNNNNN? 5’ 3’ 第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎 III類限制性內切酶 在完全肯定的位點切割 DNA，但反應需要 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。 它們的識別位點分別是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位點則在 下游 2426bp 處。在基因工程操作中用途不大。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎2. DNA連接酶 DNA連接酶（ ligase)的發(fā)現(xiàn) 從細菌 DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條 DNA雙鏈連接到一起的酶。DNA復制一定有斷口，斷口一定由酶連接第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎 DNA ligase的特點的特點 兩種兩種 DNA連接酶連接酶（（ 1）大腸桿菌連接酶：）大腸桿菌連接酶： 只能連接粘性末端。只能連接粘性末端。 （（ 2）） T4噬菌體的連接酶：噬菌體的連接酶： 不但能連接粘性末端，還能連接平末端。不但能連接粘性末端，還能連接平末端。 連接條件連接條件（（ 1）必須是兩條）必須是兩條 雙鏈雙鏈 DNA。 （（ 2）） DNA3’端有游離的端有游離的 OH， 5’端有一個磷酸基團（端有一個磷酸基團（ P）。）。（（ 3）需要）需要 能量能量 動物或噬菌體中：動物或噬菌體中： ATP 大腸桿菌中：大腸桿菌中： NAD+第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎3. DNA聚合酶 基因工程中常用的 DNA聚合酶 大腸桿菌 DNA聚合酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 修飾過的 T7 DNA聚合酶 逆轉錄酶第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎 DNA聚合酶的特點 把 dNTPs連續(xù)地加到引物的 3’—OH 端。 主要區(qū)別 持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個 dNTPs而不從模板上掉下來。 其它幾種 DNA聚合酶只能連續(xù)添加 10多個 dNTPs就會從模板上解離下來。第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的酶學基礎基因工程的酶學基礎DNA聚合酶聚合酶 3’?5’外切外切酶活性酶活性5’?3’外切外切酶活性酶活性聚合速率聚合速率 持續(xù)能力持續(xù)能力大腸桿菌大腸桿菌 DNA聚合酶聚合酶 低低 有有 中中 低低Klenow fragment 低低 無無 中中 低低T4DNA聚合酶聚合酶 高高 無無 中中
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