【文章內容簡介】 數酶可用 65 oC溫育 5分鐘失活。 或用乙醇沉淀 DNA。 4. 限制酶酶切反應的終止 5. 幾種常用限制酶識位點 （一） 功能： 保護宿主 DNA不被相應的限制酶切割。 二、 甲基化酶 在大腸桿菌中大多數都有如下位點特異的甲基化酶。 （二） 甲基化酶的種類 Dam甲基化酶 GATC， AN6甲基腺嘌呤 BamHⅠ :GGATCC Dcm甲基化酶 CCAGG ， CCTGG, C5甲基胞嘧啶 EcoRⅡ ： CCAGG （三） 甲基化對限制酶切的影響 基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。 如果限制性內切酶的識別位點是從表達 Dam或 Dcm甲基化酶的菌株中分離而得，并且其甲基化識別位點與內切酶識別位點有重疊，那么該限制性內切酶的部分或全部酶切位點有可能不被切割 。 修飾酶切位點 三、 DNA連接酶 (DNA ligase) 定義 催化雙鏈 DNA片段靠在一起的 3`OH末端和5`P 末端形成 3`,5`磷酸二酯鍵，使兩末端連接的一種核酸酶。 OH P 5` 3` 3` 5` 5` 3` 3` 5` DNA ligase DNA ligase 連接缺刻 (nick) 種類 （ 1）大腸桿菌連接酶 只能連接粘性末端。 （ 2） T4噬菌體的連接酶 不但能連接粘性末端， 還能連接齊平末端。 依據來源可分為兩類 : 1) 修復雙鏈 DNA上缺口處的磷酸二酯鍵 。 DNA連接酶的基本性質 nick OH P 5‘ … GCTCTGCA GGAG … 3’ 3‘ … CGAG ACGTCCTC … 5’ P OH nick DNA連接酶 5‘ … GCTCTGCAGGAG … 3’ 3‘ … CGAGAC GTCCTC … 5’ 2) 修復與 RNA鏈結合的 DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵 5‘ … GCUCUGCCGGAG … 3’ 3‘ … CGAG ACGGCCTC … 5’ P nick OH T4DNA連接酶 5‘ … GCUCUGCCGGAG … 3’ 3‘ … CGAGACGGCCTC … 5’ 3)連接多個平頭雙鏈 DNA分子： 5‘ … GCTCAGOH PCTGGAG … 3’ 3‘ … CGAGTCP OHGACCTC … 5’ T4DNA連接酶 5‘ … GCTCAGCTGGAG … 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTC … 5’ TrisHCl 50100 mM pH MgCl2 10 mM ATP mM DTT 5 mM Volume 10 20 ml T T 4 15 ℃ 4 16 hr DNA連接酶的反應條件 1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應條件下15 ℃ 反應 1 小時，完全連接 1 mgλDNA（ Hind III片段）所需的酶量。 （ 1）必須是兩條雙鏈 DNA。 ? 不能催化兩單鏈 DNA分子連接； ? 只能連雙鏈 DNA分子的單鏈缺刻 (nick)；不能 連接雙鏈中一個或多個核苷酸缺失所致缺 (gap)。 連接條件 DNA ligase 的活性 （ 2） DNA3’端有游離的 OH， 5’端有一個磷酸基團（ P）。 （ 3）需要能量 動物或噬菌體中： ATP 大腸桿菌中： NAD+ 連接條件 連接酶反應的最佳溫度是 37?C。 連接反應的溫度 最佳溫度 在 37℃ 下粘性末端的結合很不穩(wěn)定。 實用溫度 所以一般采用 4~16 ?C。 平頭雙鏈 DNA片段的連接操作 從分子動力學的角度講，由限制性核酸內切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于 分子內部的連接 ，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢得多 。 提高平頭末端連接效率的方法包括： ?加大連接酶用量（ 10倍大于粘性末端的連接） ?加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會 ?加入 10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用 ?加入單價陽離子（ NaCl），最終濃度 150200 mM （一）基因工程中常用的 DNA聚合酶： 1. 大腸桿菌 DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T4 噬菌體 DNA聚合酶 4. T7 噬菌體 DNA聚合酶 5. 耐熱 DNA聚合酶 6. 反轉錄酶 四、 DNA聚合酶 1. 共同特點 把 dNTPs連續(xù)地加到引物的 3’ — OH端。 2. 主要區(qū)別 T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數千個 dNTPs而不從模板上掉下來。 其它幾種 DNA聚合酶只能連續(xù)添加 10多個 dNTPs就會從模板上解離下來。 （二）常用的 DNA聚合酶的特點 持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。 （三） DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大腸桿菌 DNA聚合酶 I （ 1）大腸桿菌 DNA聚合酶 I 的性質 ①一條單鏈多肽。 ⑤ 5’ ?3’ 外切酶活性位于 N端。 ⑥ 用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉 N端的 5’ ?3’外切酶活性部分。就成為Klenow fragment。 ② 5’ ?3’ DNA聚合酶活性。 ③ 5’ ?3’ 外切酶活性 ④ 3’ ?5’外切酶活性 ① 底物： dNTPs（ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP） ② Mg2+ ③ 帶有 3’ OH游離端的引物 ④ DNA模板 （ 2） DNA聚合酶 I（ Pol I）的反應條件 OH 5’ 3’ dNTPs 標記 ① 核酸探針（ probe） 能夠同某種被研究的核酸序列特異性結合的，帶有標記的寡聚核酸分子。 （ 3）用 DNA聚合酶 I 制備探針 已知序列的核酸片斷 顯示位置 與互補的待測序列雜交 標記 已知序列的核酸片斷 ② 探針的標記方式 標記 已知序列的核酸片斷 帶有放射性的已知序列的核酸片斷 5’ 3’ ③ DNA聚合酶 I 對探針序列的標記 切口轉移法 (nick translation )： 放射性同位素標記： DNA聚合酶 I 同時具備 5’ ?3’ 外切酶活性和 5’ ?3’的聚合酶活性（以及 3’ ?5’ 外切酶活性）。 5’ ?3’外切酶活性從 DNA切口的下一段 DNA的 5’端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的上一段DNA的 3’一側補上一個新的核苷酸。 切口 切口 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 純化的 DNA片段 DNase I 制造單鏈切口 DNA Pol I 進行切口轉移 一種 ?32PdNT