dna-酶切、回收和連接(編輯修改稿)
2024-08-31 17:39 本頁面
【文章內容簡介】 DNA樣品； ⑤ 彈勻 ， 短暫離心； ⑥ 置所用限制性內切酶最適溫度水浴中 ， 酶切 1~3小時 ，酶切過夜則建議改用稍大的酶切體積 ， 以避免水分蒸發(fā)過多影響的酶切體系各組分濃度改變過大 。 ⑦ 置 65℃ 水浴中 10分鐘 ， 對限制性內切酶進行滅活 ， 不同的酶滅活條件可能不同 ， 請參照說明書進行 。 ⑧ 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切反應的結果 。 ⑨ 反應體系： 10 內切酶緩沖液 2?l DNA ?g 限制性內切酶 25單位 用滅菌的 ddH2O補至 20?l， 37℃ 1小時。可根據需要按比例放大。 pGFPuv和 pBSK的酶切體系： 酶切體系 質粒載體（ pGFPuv和 pBSK） 10 RE buffer (E) 6 ?l 100 BSA ?l DNA 6 ?g EcoR I ?l Hind III ?l ddH2O X ?l → 合計 60 ?l 充分混勻后，用離心機短時（ 10秒）離心，于 37℃ 保溫 34小時或過夜， 65℃ 保溫 10分鐘使限制性內切酶失活。 五 .注意事項 ? 酶的定義 : 在標準條件下 ,1小時完全消化 1μg線型 DNA分子所需的酶量定義為 1U； ? 影響限制性內切酶活性的生物因子： 1. 酶切割位點周圍核苷酸兩側的堿基的性質； 2. 識別序列在 DNA中的分布頻率； 3. 與 DNA的構象有關（ SC,L,OC）；
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