dna片段擴(kuò)增及dna連接-pcr講解(編輯修改稿)
2025-02-08 08:02 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 (7) T is the best candidate at 3’ end ？ 小結(jié) : 引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)遵循的原則 (＊ ) General rules for Primer design 引物的設(shè)計(jì)實(shí)例 (＊ ) 已知 IFN? cDNA序列 , 你該如何設(shè)計(jì)引物？ at gaaatataca agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag gacccatatg taaaagaagc agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat gtagcggata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac agaaaaataa tgcagagcca attgtctcc ttttacttca aactttttaa aaactttaaa gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt ttcaatagca acaaaaagaa acgagatgac ttcgaaaagc tgactaatta ttcggtaact gacttgaatg tccaacgcaa agcaatacat gaactcatcc aagtgatggc tgaactgtcg ccagcagcta aaacagggaa gcgaaaaagg agtcagatgc tgtttcaagg tcgaagagca tcccagtaa at gaaatataca agt gaagagca tcccagtaa at gaaatataca agt 3’ 5’ 3’ 5’ 上游 (5’ )引物的結(jié)合 CTTCTCGTAGGGTCATT 下游 (3’ )引物的結(jié)合 設(shè)計(jì)引物時(shí) : 5′ 引物與位于待擴(kuò)增片段 5′ 上游的一小段 DNA序列相同，以信息鏈的互補(bǔ)鏈為模板，引導(dǎo)信息鏈的合成 。 3′ 引物與擴(kuò)增片段 3′ 端的一小段 DNA序列互補(bǔ) ，引導(dǎo)互補(bǔ)鏈的合成。 PCR反應(yīng)擴(kuò)增的就是這一對引物之間的 DNA片段。 答： 5’引物照抄， 3’引物互補(bǔ)倒讀 ； 酶切位點(diǎn)加在引物的 5’； 調(diào) GC含量的堿機(jī)放在最前邊； 此外無發(fā)夾結(jié)構(gòu)、與基因組其它區(qū)域的同源性較差。 at gaaatataca agt gaagagca tcccagtaa atg aaatataca agt 3’ 5’ 3’ 5’ 上游 (5’ )引物的結(jié)合 CTTCTCGTAGGGTCATT 下游 (3’ )引物的結(jié)合 : For G+C content Sense primer: 5’－ GCAGCGGATCC ATG AAATATACAAGT－ 3’ 15 bp GC=11 AT=15 AntiSense primer: 5’－ ATCGGAATTC TTA CTGGGATGCTCTTC－ 3’ 17 bp BamHI start codon GC=12 AT=15 EcoRI stop codon 引物的方向是 5?→3 ?： 特異性序列是否少了點(diǎn) ? 通常在引物的 5‘端設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn) 引物設(shè)計(jì)軟件介紹： Primer Premier ? 顧名思義，該軟件就是用來進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的。可以簡單地通過手動拖動鼠標(biāo)以擴(kuò)增出相應(yīng)片段所需的引物，而在手動的任何時(shí)候，下面顯示各種參數(shù)的改變和可能的二聚體、異二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。也可以給定條件，讓軟件自動搜索引物，并將引物分析結(jié)果顯示出來。而且進(jìn)行這些操作非常簡單 Oligo ? 引物分析著名軟件，主要應(yīng)用于核酸序列引物分析設(shè)計(jì)軟件，同時(shí)計(jì)算核酸序列的雜交溫度（ Tm）和理論預(yù)測序列二級結(jié)構(gòu)。 Primer D39。Signer ? 免費(fèi)的引物設(shè)計(jì)輔助軟件，專門用于 pASKIBA和 pPRIBA表達(dá)載體，簡化引物設(shè)計(jì)工作。 四． PCR反應(yīng)注意事項(xiàng) Optimization of PCR condition ＊ PCR方法操作簡便， 但影響因素頗多。 去離子水 （ 補(bǔ)足反應(yīng)體系 ） 39 ?l 模板 2 ?l 10?PCR buffer（ 含 MgCl2） 5 ?l dNTPs (10mmol/L) 1 ?l 5’引物 (sense 10?mol/L) ~1 ?l 3’引物 (antisense 10?mol/L) ~1 ?l Taq DNA pol. (2U/?l) 1 ?l 輕彈管底混合 （ 用離心機(jī)甩一下 ） （一）、 PCR反應(yīng)體系 final volume 50?l 加各種成分 最好 在冰上進(jìn)行。 1. 模板 DNA 不是越多越好 ： 2 ?l 1)在一定范圍內(nèi) PCR產(chǎn)量隨模板濃度的升高而顯著升高， 2)但 模板濃度過高會導(dǎo)致引物無法與模板結(jié)合 ，反應(yīng)的非特異性增加。 3)一般采用 102?105拷貝的待擴(kuò)增片段作為模板 : 微克水平的基因組 DNA、重組質(zhì)粒 DNA用 ng水平的量 。 4)模板過多還能大量消耗鎂離子。 The amount of template—“more is less”. Don’t add too much template Template DNA 不能含有其提取時(shí)所用試劑： 提取 genomic DNA 的基本過程： （ 1）裂解細(xì)胞，消化蛋白質(zhì)，抑制 DNase activity proteinase K＋ SDS＋ EDTA （ 2）然后用 酚 － 氯仿 多次抽提，去除蛋白質(zhì) （ 3）用 RNase去除 RNA （ 4）用 乙醇 沉淀 DNA， air dry, 無菌水溶解。 2. 引物 ： ?l Primer 1: OD=5 PCR 反應(yīng)引物濃度為 ~,引物與模板的摩爾比至少為 108： 1。 如此過量的引物才能確保模板 DNA一旦變性就與引物退火 ， 而不能與其自身退火 。 ? 但引物濃度太高， （ 1）會增大引物結(jié)合到不嚴(yán)格配對區(qū)域的機(jī)會，這樣的錯配會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增 。 （ 2）可增加引物之間形成二聚體的幾率，降低擴(kuò)增效率。 ? 但如果該比例太低， PCR效率也會降低。 primers 引物的配制 Primer 1: OD=5 注意： ?凍干品，計(jì)算一管引物的總含量或克分子數(shù) ?先配成 100mM的濃度作為儲存液 ?工作液 : 10?mol/L, 20℃ 保存。
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