dna片段擴增及dna連接-pcr講解(已修改)
2025-01-24 08:02 本頁面
【正文】 一、 PCR實驗背景 二、 PCR基本原理 三、 PCR引物設(shè)計原則 四、 PCR反應(yīng)注意事項 五、常見問題與對策 六、 PCR的應(yīng)用 講解內(nèi)容 第二次實驗課、 DNA片段擴增及 DNA連接 一．實驗背景 ? The polymerase chain reaction (PCR) is invented by K. Mullis in 1985. ? This technique is used to amplify a specific sequence of DNA in vitro by simulating the replication procedure of natural DNA in vivo. ? PCR enable us to unlimitedly amplify DNA fragments. The Nobel Prize in Chemistry 1993 體外擴增特異 DNA片段 二． PCR基本原理 3’ 5’ 3’ 5’ PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ target sequence 在模板、引物、 4種 dNTP和耐熱 DNA聚合酶存在的條件下， 特異擴增 位于兩段已知序列之間的 DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。 模板（ DNA或 cDNA） 2 ?l 10?PCR buffer（ 含 MgCl2） 5 ?l dNTPs (10mmol/L) 1 ?l 5’引物 (10?mol/L) 1 ?l 3’引物 (10?mol/L) 1 ?l 去離子水 （ 補足反應(yīng)體系 ） 39 ?l Taq DNA pol. (2U/?l) 1 ?l 輕彈管底混合 （ 用離心機甩一下 ） 50?l 在一微量離心管中 依次 加入下列試劑： ?加入順序不是隨機的： DNA聚合酶一定要最后加入。 PCR儀設(shè)定的反應(yīng)條件： 94oC 45 S DNA變性 55 oC 45 S DNA復性 72 oC 1 min 產(chǎn)物鏈延伸 2530個循環(huán)后 72 oC 10 min 一般地，基因片段在 5001000bp左右時，可按下列條件進行 PCR： 介紹： PCR儀 如果上蓋加熱的 PCR儀，可以直接放入儀器中進行 PCR； 如果下面加熱的 PCR儀，加入 2滴礦物油后，加入儀器中，不過這種儀器現(xiàn)在已經(jīng)很少用到。 PCR儀 內(nèi)發(fā)生的反應(yīng) 變性 退火 延伸 5? 5? 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） PCR的基本原理 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復性 子鏈延伸 DNA加倍 DNA變性 形成2條單鏈 模板 DNA 95℃ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 95℃ 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 72℃ 第 1輪結(jié)束 95℃ 第 2輪開始 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 72℃ 第 2輪結(jié)束 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律 反應(yīng)初期 ， 目的 DNA片段呈指數(shù)擴增 。 隨著目的 DNA產(chǎn)物逐漸積累 ， 在引物 、 模板與 DNA聚合酶達到一定比例時 ， 酶的催化反應(yīng)趨于飽和 ，此時擴增 DNA片段的增加減慢進入相對穩(wěn)定狀態(tài) ， 即出現(xiàn) “ 停滯效應(yīng) ” ， 又稱 “ 平臺期 ” 。 到達平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù) 、 PCR擴增效率等因素 。 predenaturation 95℃ for 5min。 Denaturation: 95℃ for 30~60s Annealing: 37~68℃ for 30~60s extension: 72℃ for 30s~2min 72℃ extension for 10 min 30 cycles ?反應(yīng)分三步： ① 變性 （ denaturation）； ② 退火（ annealing）； ③ 延伸（ extension） ? PCR反應(yīng)成功擴增的一個關(guān)鍵條件在于引物的正確設(shè)計。引物設(shè)計的總原則就是提高擴增的特異性 ，這取決于引物與模板的特異結(jié)合。 ? PCR反應(yīng)中有兩條引物，即 5′ 引物和 3′ 引物。 三、 PCR引物的設(shè)計 引物設(shè)計 的 基本原則 引物的設(shè)計實例 (＊ ) PCR 引物設(shè)計 的 基本原則 cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。 在 NCBI上搜索該基因。通過序列同源性比較軟件（比如DNAman）比對（ Alignment），相同的序列就是其保守區(qū)。 方向 永遠是 5?→3 ? 引物長度一般在 15~30核苷酸 之間。 引物長度（ primer length）常用的是 1827 bp。 過短會使 PCR的特異性降低；過長沒有必要。 引物 3′端要避開密碼子的第 3位。 因為密碼子的第 3位易發(fā)生不改變 aa突變。 3’端是 DNA延伸的起點，因此一定要嚴格與模板 DNA配對。 尤其是引物 3′末
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