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實(shí)驗(yàn)二gstz基因的pcr擴(kuò)增(已修改)

2025-03-05 23:35 本頁面
 

【正文】 實(shí)驗(yàn)二 GSTZ基因的 PCR擴(kuò)增 Amplifying GSTZ gene by Polymerase Chain Reaction 核酸的體外擴(kuò)增 ? 真核細(xì)胞內(nèi) DNA的復(fù)制 ? 聚合酶鏈反應(yīng)( Polymerase Chain Reaction, PCR) The Nobel Prize in Chemistry 1993 for contributions to the developments of methods within DNAbased chemistry for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method Kary B. Mullis La Jolla, CA, USA B:1944 一、 PCR的基本原理: 一種模擬天然 DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增法 PCR反應(yīng)三部曲: 變性 (denature): 加熱使雙鏈 DNA解開螺旋 ↓ 退火 (annealing) 在退火溫度條件下引物同模板雜交 ↓ 延伸 (extend) 在 Taq DNA聚合酶, dNTPs, Mg2+ 和合適 pH緩沖液存在條件下延伸引物 PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 試劑 原液濃度 工作濃度 50?l體系 PCR緩沖液 10? 1? 5?L 上游引物 10?mol/L ?mol/L ?L 下游引物 10?mol/L ?mol/L ?L dNTPs ?mol/L 4?L MgCl2 25mmol/L ?L DNA模板 ~ 10ng ddH2O 補(bǔ)足 ?L Taq酶 1U/?L ?L體系 2. 5?L PCR PARAMETER ? Predenature: 94℃ 5min ? PCR Cycles: ? Denature 94 ℃ 40sec ? Annealing 58 ℃ 35sec ? Extend 72 ℃ 1min30sec ?Totally 35~40 cycles ? Postextend: 72 ℃ 7min PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 引物 人工合成的寡核苷酸 ?一般 PCR 反應(yīng)中引物的終濃度為 1?mol/L, 在此范圍內(nèi)產(chǎn)物量基本相同 。 引物濃度低于 ?mol/L時(shí) , 產(chǎn)物量降低;引物濃度過高會(huì)引導(dǎo)非特異產(chǎn)物擴(kuò)增 , 還會(huì)增加引物二聚體的形成 。 引物設(shè)計(jì)原則:軟件 +經(jīng)驗(yàn) ? 引物長(zhǎng)度以 1530個(gè)堿基為宜; ? 引物堿基盡可能隨機(jī)分布, G+C含量宜在45~55%左右; ? 引物內(nèi)部、引物之間不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu); ? 避免重復(fù)多聚堿基; ? 引物與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無明顯同源性; ? 兩個(gè)引物的 Tm值要盡可能接近; 重組時(shí)引物設(shè)計(jì)的其它幾個(gè)問題: 引物 A ATTGGATCCATGGCGAATTCCGGCGAAG
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