實驗二gstz基因的pcr擴增(完整版)
【正文】 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40CycleΔRnThreshold 104 103 102 常用的熒光定量 PCR試劑 SYBR Green I TaqMan TaqMan probe Hybridises with the target amplicon Is 339。 M 1 2 PCR常見問題之三 1. 模板不純 2. Buffer不合適 3. 退火溫度偏低 4. 酶量過多 5. dNTP、 Mg2+濃度偏高 6. 循環(huán)次數(shù)過多 原因 對 策 1. 純化模板 2. 更換 Buffer 3. 適當(dāng)提高退火溫度 4. 適量用酶 5. 適當(dāng)降低 dNTP和 鎂離子 的濃度 6. 減少循環(huán)次數(shù) ? 拖尾 PCR常見問題之四 ? 假陽性 （ 篩選轉(zhuǎn)基因 、 檢測基因表達情況 ) ? 原因： 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 ? 現(xiàn)象： 空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物 ? 對策： 1. 操作時應(yīng)小心輕柔 ， 防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外； 2. 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外 ， 所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒 。 3～ 4kb的靶序列需 3～ 4min；擴增 10Kb需延伸至 15min。 Generally, low Mg2+ leads to low yields (or no yield) high Mg2+ leads to accumulation of nonspecific products (mispriming). The MgCl2 concentration in the final reaction mixture is usually between to , 試劑 原液濃度 工作濃度 50?l體系 PCR緩沖液 10? 1? 5?L 上游引物 10?mol/L ?mol/L ?L 下游引物 10?mol/L ?mol/L ?L dNTPs ?mol/L 4?L MgCl2 25mmol/L ?L DNA模板 ～ 10ng ddH2O 補足 ?L Taq酶 1U/?L ?L體系 2. 5?L 循環(huán)參數(shù) ? 變性溫度和時間 ? 復(fù)性溫度和時間 ? 延伸溫度和時間 ? 循環(huán)數(shù) 變性溫度與時間 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR失敗的最主要原因。 引物設(shè)計原則：軟件 +經(jīng)驗 ? 引物長度以 1530個堿基為宜； ? 引物堿基盡可能隨機分布， G+C含量宜在45~55%左右； ? 引物內(nèi)部、引物之間不應(yīng)形成二級結(jié)構(gòu)； ? 避免重復(fù)多聚堿基； ? 引物與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無明顯同源性； ? 兩個引物的 Tm值要盡可能接近； 重組時引物設(shè)計的其它幾個問題： 引物 A ATTGGATCCATGGCGAATTCCGGCGAAGA (BamH I) 引物 B ACCAAGCTTGATGGTGGAAGAAGGAGC (Hind III) PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 三磷酸脫氧核苷（ dNTPs） ?四種三磷酸脫氧核苷 （ dATP、 dCTP、dGTP、 dTTP） 是 DNA合成的基本原料 ， 工作濃度應(yīng)為 20~200?mmol/L。 PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 prime
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