實(shí)驗(yàn)二 gstz基因的pcr擴(kuò)增-文庫吧
2025-02-06 23:35 本頁面
【正文】 A (BamH I) 引物 B ACCAAGCTTGATGGTGGAAGAAGGAGC (Hind III) PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 三磷酸脫氧核苷（ dNTPs） ?四種三磷酸脫氧核苷 （ dATP、 dCTP、dGTP、 dTTP） 是 DNA合成的基本原料 ， 工作濃度應(yīng)為 20~200?mmol/L。 所用的四種dNTP的濃度應(yīng)相等 ， 以使錯(cuò)誤摻入率降至最低 。 dNTPs 濃度過低則反應(yīng)速度下降 ， dNTPs濃度過高則擴(kuò)增特異性降低 ， 而且當(dāng)dNTP濃度高于 50mM時(shí)也會抑制 Taq DNA聚合酶的活性 。 PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 耐熱 DNA聚合酶 ?Taq聚合酶是從耐熱菌 （ thermus aquatious） 中提取出來的耐熱酶 ， 95℃ 仍有活性 。 該酶的應(yīng)用濃度一般為 1~?L反應(yīng)體系 ， 然而 ， 酶的用量可依據(jù)不同的模板分子或引物而變化 。 酶濃度過高時(shí) ， 會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；過低時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量很低 。 反應(yīng)緩沖液 ?TrisHCl ?KCl ?酶的穩(wěn)定劑 A typical reaction buffer for PCR would something like: 10mM Tris, pH 50mM KCl % gelatin PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 Mg2+ ?Mg2+ 是 Taq DNA聚合酶活性所必需的 。Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實(shí)性 、產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等等 。 Generally, low Mg2+ leads to low yields (or no yield) high Mg2+ leads to accumulation of nonspecific products (mispriming). The MgCl2 concentration in the final reaction mixture is usually between to , 試劑 原液濃度 工作濃度 50?l體系 PCR緩沖液 10? 1? 5?L 上游引物 10?mol/L ?mol/L ?L 下游引物 10?mol/L ?mol/L ?L dNTPs ?mol/L 4?L MgCl2 25mmol/L ?L DNA模板 ～ 10ng ddH2O 補(bǔ)足 ?L Taq酶 1U/?L ?L體系 2. 5?L 循環(huán)參數(shù) ? 變性溫度和時(shí)間 ? 復(fù)性溫度和時(shí)間 ? 延伸溫度和時(shí)間 ? 循環(huán)數(shù) 變性溫度與時(shí)間 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR失敗的最主要原因。一般情況下， 93℃ ～ 94℃ 1min足以使模板 DNA變性，若低于 93℃ 則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致 PCR失敗。 退火 (復(fù)性 )溫度與時(shí)間 ? 退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。引物的復(fù)性溫度可通過
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