【正文】 為東 聚合酶鏈反應 《分子生物學基本實驗技術》 2006年1月第1版 9196頁?？蓮?05～106 細胞中檢出一個癌變細胞。（6）預混和分裝PCR試劑:PCR反應液應預先配制好，然后小量分裝。苯酚腐蝕性很強。按下列程序依次加入試劑，按50μl反應體積配制PCR反應體系(注意：水先加，然后依次加入其他試劑，模板DNA最后加) PCR方法(1)[注意：實驗中應設立對照。④待膠徹底凝固后，輕輕拔出梳子⑤將內槽放入電泳槽內，加入1TAE電泳緩沖液至電泳槽中，使其沒過凝膠表面12mm，排除加樣孔中的氣泡。（7）小心取出上清液，用預冷的二倍體積的無水乙醇沉淀DNA，室溫放置10min以上，12000r/min離心10min,棄上清液?！姹４?。（2）滅菌：將平板2塊與裝有培養(yǎng)基的錐形瓶分別包扎， mL的離心管置于密封容器中，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。當然 DNA 模板 (Template) 與 引信 (Primers) 本身條件也占有一定的重要性。(1+E)2=…=X通常經2530 輪循環(huán)擴增后, 反應中Taq DNA 聚合酶已經不足, 如果此時產物量仍不夠, 需要進一步擴增,可將擴增的DNA 樣品稀釋103105倍作為模板, 重新加入各種反應底物進行擴增, 這樣經60 輪循環(huán)后, 擴增水平可達1091010。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環(huán), 既省時間又提高了特異性。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。⑤引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。利用PCR技術可在數小時之內大量擴增目的基因或DNA片段，從而免除基因重組和分子克隆等一系列繁瑣操作。 瓊脂糖凝膠電泳原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。用無DNA酶的RNA酶水解溶液中的RNA，最終獲得純度較高的細菌DNA。其主要步驟是：待擴增DNA于高溫下解鏈成為單鏈模板；人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側的兩條鏈互補結合；DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物3’端開始摻入，沿模板5’→3’方向延伸，合成DNA 新股。它具有強大的擴增能力，并且可與其他分子生物學方法和免疫學方法相結合應用，使其敏感性和特異性都大大增強。 生物合成LDOPA 上世紀 60 年代，國外許多學者開始致力于微生物酶法合成LDOPA的研究。Birkmayer于1961年用左旋多巴治療PD獲得明顯療效[2]。PCR技術能夠快速特異地擴增任何目的基因或DNA片段，它不僅可以用于基因分離、克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構建、基因表達調控的研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機制探查、法醫(yī)鑒定等諸多方面。PCR技術已成為方法學上的一次革命，它必將大大推動分子生物學各學科和研究進展。LDOPA及復方左旋多巴（如美多芭）已成為治療常見老年病——帕金森氏病的主要藥物[3,4]。Larway 和Evans首次在嗜酪氨酸微螺菌（Microspiratyrasinatica）中發(fā)現了與LDOPA形成有關的酪氨酸酶[6]。由于PCR對世界生物醫(yī)學研究的巨大推動作用，其發(fā)明者Saiki因而獲得1992年諾貝爾醫(yī)學獎。由于每一周期所產生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，所以PCR產物以指數方式增加，經過2530次周期之后，理論上可增加109倍，實際上至少可擴增105倍，一般可達106107。溶菌酶（lysozyme）是一種能水解粘多糖的堿性酶，它通過破壞細菌細胞壁中的N乙酰胞壁酸和N乙酰氨基葡萄糖之間的β1,4糖苷鍵，使細胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，從而使細菌細胞壁破裂。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷在電場中向正極移動。由于這種方法操作簡單、實用性強、靈敏度高并可自動化，因而在分子生物學、基因工程研究以及對遺傳病、傳染病和惡性腫瘤等基因診斷和研究中得到廣泛應用PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。⑥引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火一般僅需數秒鐘即可完成,反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。擴增產物的量還與擴增效率有關,擴增產物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。(1+E)n0≤E≤1其中E表示擴增效率，Yn表示在n個周期后PCR產物的分子數量，Yn1為n1個周期后PCR產物的分子數量。近來的觀念中，共溶劑諸如 Dimethyl sulfoxide (DSMO) 、 glycerol 、 Foramide and Tetramethylammonium chloride (TMAC) 也對整個反應產生若干重要的影響。（3）倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。 SDS法制備細菌基因組DNA（1）菌體收集：取已經培養(yǎng)過夜的弗氏檸檬酸桿菌菌懸液（34914或35114），12000r/min離心1min，棄上清，收集菌體（注意吸干多余的水分）。（沉淀質粒）（8）用1mL 70%乙醇洗滌沉淀12次，12000r/min離心10min，棄上清液。（3）加樣：將5μ L樣品與1μL 6x上樣緩沖液混合，用移液槍將該混合樣品加入樣品孔（樣品不可溢出，記錄點樣順序及點樣量）。陰性對照(不加模板DNA)可加去離子水代替]。吸取氯仿 異戊醇時要在通風櫥中進行，氯仿 可引起神經系統功能紊亂要引起肝臟損害 。節(jié)省時間并保證各管成分平行 ?？煽焖俸啽闱逸^為安全地進行遺傳性疾病的胎兒期診斷. 從而使臨床分析上升到了分子生物學檢測水平.致謝由衷的感謝韋老師，老師們淵博學識和嚴謹學風將使我受益終生，激勵我在未來的學習和工作中不斷奮進。衷心的感謝邱老師平時對我們孜孜不倦的教誨和對實驗的關心與指導，老師治學嚴謹，為人熱誠大方，工作一絲不茍，使我受益頗多。（7）培養(yǎng)細菌的容器用過后都要及時進行滅菌，細菌培養(yǎng)基上清不要隨便丟棄，應存放