【正文】 為東 聚合酶鏈反應(yīng) 《分子生物學(xué)基本實驗技術(shù)》 2006年1月第1版 9196頁?？蓮?05～106 細(xì)胞中檢出一個癌變細(xì)胞。（6）預(yù)混和分裝PCR試劑:PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝。苯酚腐蝕性很強。按下列程序依次加入試劑，按50μl反應(yīng)體積配制PCR反應(yīng)體系(注意：水先加，然后依次加入其他試劑，模板DNA最后加) PCR方法(1)[注意：實驗中應(yīng)設(shè)立對照。④待膠徹底凝固后，輕輕拔出梳子⑤將內(nèi)槽放入電泳槽內(nèi)，加入1TAE電泳緩沖液至電泳槽中，使其沒過凝膠表面12mm，排除加樣孔中的氣泡。（7）小心取出上清液，用預(yù)冷的二倍體積的無水乙醇沉淀DNA，室溫放置10min以上，12000r/min離心10min,棄上清液?！姹４妗＃?）滅菌：將平板2塊與裝有培養(yǎng)基的錐形瓶分別包扎， mL的離心管置于密封容器中，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。當(dāng)然 DNA 模板 (Template) 與 引信 (Primers) 本身條件也占有一定的重要性。(1+E)2=…=X通常經(jīng)2530 輪循環(huán)擴增后, 反應(yīng)中Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時產(chǎn)物量仍不夠, 需要進一步擴增,可將擴增的DNA 樣品稀釋103105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進行擴增, 這樣經(jīng)60 輪循環(huán)后, 擴增水平可達1091010。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環(huán), 既省時間又提高了特異性。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。⑤引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。利用PCR技術(shù)可在數(shù)小時之內(nèi)大量擴增目的基因或DNA片段，從而免除基因重組和分子克隆等一系列繁瑣操作。 瓊脂糖凝膠電泳原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。用無DNA酶的RNA酶水解溶液中的RNA，最終獲得純度較高的細(xì)菌DNA。其主要步驟是：待擴增DNA于高溫下解鏈成為單鏈模板；人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補結(jié)合；DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物3’端開始摻入，沿模板5’→3’方向延伸，合成DNA 新股。它具有強大的擴增能力，并且可與其他分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法相結(jié)合應(yīng)用，使其敏感性和特異性都大大增強。 生物合成LDOPA 上世紀(jì) 60 年代，國外許多學(xué)者開始致力于微生物酶法合成LDOPA的研究。Birkmayer于1961年用左旋多巴治療PD獲得明顯療效[2]。PCR技術(shù)能夠快速特異地擴增任何目的基因或DNA片段，它不僅可以用于基因分離、克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達調(diào)控的研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機制探查、法醫(yī)鑒定等諸多方面。PCR技術(shù)已成為方法學(xué)上的一次革命，它必將大大推動分子生物學(xué)各學(xué)科和研究進展。LDOPA及復(fù)方左旋多巴（如美多芭）已成為治療常見老年病——帕金森氏病的主要藥物[3,4]。Larway 和Evans首次在嗜酪氨酸微螺菌（Microspiratyrasinatica）中發(fā)現(xiàn)了與LDOPA形成有關(guān)的酪氨酸酶[6]。由于PCR對世界生物醫(yī)學(xué)研究的巨大推動作用，其發(fā)明者Saiki因而獲得1992年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。由于每一周期所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，所以PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)過2530次周期之后，理論上可增加109倍，實際上至少可擴增105倍，一般可達106107。溶菌酶（lysozyme）是一種能水解粘多糖的堿性酶，它通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁中的N乙酰胞壁酸和N乙酰氨基葡萄糖之間的β1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，從而使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷在電場中向正極移動。由于這種方法操作簡單、實用性強、靈敏度高并可自動化，因而在分子生物學(xué)、基因工程研究以及對遺傳病、傳染病和惡性腫瘤等基因診斷和研究中得到廣泛應(yīng)用PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。⑥引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，最佳選擇是G和C。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時間主要是為使整個反應(yīng)體系達到合適的溫度。擴增產(chǎn)物的量還與擴增效率有關(guān),擴增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。(1+E)n0≤E≤1其中E表示擴增效率，Yn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn1為n1個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。近來的觀念中，共溶劑諸如 Dimethyl sulfoxide (DSMO) 、 glycerol 、 Foramide and Tetramethylammonium chloride (TMAC) 也對整個反應(yīng)產(chǎn)生若干重要的影響。（3）倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。 SDS法制備細(xì)菌基因組DNA（1）菌體收集：取已經(jīng)培養(yǎng)過夜的弗氏檸檬酸桿菌菌懸液（34914或35114），12000r/min離心1min，棄上清，收集菌體（注意吸干多余的水分）。（沉淀質(zhì)粒）（8）用1mL 70%乙醇洗滌沉淀12次，12000r/min離心10min，棄上清液。（3）加樣：將5μ L樣品與1μL 6x上樣緩沖液混合，用移液槍將該混合樣品加入樣品孔（樣品不可溢出，記錄點樣順序及點樣量）。陰性對照(不加模板DNA)可加去離子水代替]。吸取氯仿 異戊醇時要在通風(fēng)櫥中進行，氯仿 可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂要引起肝臟損害 。節(jié)省時間并保證各管成分平行 。可快速簡便且較為安全地進行遺傳性疾病的胎兒期診斷. 從而使臨床分析上升到了分子生物學(xué)檢測水平.致謝由衷的感謝韋老師，老師們淵博學(xué)識和嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)將使我受益終生，激勵我在未來的學(xué)習(xí)和工作中不斷奮進。衷心的感謝邱老師平時對我們孜孜不倦的教誨和對實驗的關(guān)心與指導(dǎo)，老師治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，為人熱誠大方，工作一絲不茍，使我受益頗多。（7）培養(yǎng)細(xì)菌的容器用過后都要及時進行滅菌，細(xì)菌培養(yǎng)基上清不要隨便丟棄，應(yīng)存放