實(shí)驗(yàn)二gstz基因的pcr擴(kuò)增-wenkub
2023-03-08 23:35:31 本頁面
【正文】 sec ? Annealing 58 ℃ 35sec ? Extend 72 ℃ 1min30sec ?Totally 35~40 cycles ? Postextend: 72 ℃ 7min PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 引物 人工合成的寡核苷酸 ?一般 PCR 反應(yīng)中引物的終濃度為 1?mol/L， 在此范圍內(nèi)產(chǎn)物量基本相同 。 dNTPs 濃度過低則反應(yīng)速度下降 ， dNTPs濃度過高則擴(kuò)增特異性降低 ， 而且當(dāng)dNTP濃度高于 50mM時也會抑制 Taq DNA聚合酶的活性 。 反應(yīng)緩沖液 ?TrisHCl ?KCl ?酶的穩(wěn)定劑 A typical reaction buffer for PCR would something like: 10mM Tris, pH 50mM KCl % gelatin PCR反應(yīng)體系 ? DNA模板 template ? 引物 primers ? dNTPs ? 耐熱聚合酶 Taq DNA polymerase ? 反應(yīng)緩沖液 reaction buffer ? MgCl2 Mg2+ ?Mg2+ 是 Taq DNA聚合酶活性所必需的 。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致 PCR失敗。 延伸溫度與時間 ? Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： ? 70～ 80℃ 150核苷酸 /S/酶分子 ? 70℃ 60核苷酸 /S/酶分子 ? 55℃ 24核苷酸 /S/酶分子 ? PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 70～ 75℃ 之間，常用溫度為 72℃ ，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40CycleΔRnThreshold 104 103 102 PCR PARAMETER ? Predenature: 94℃ 3min ? PCR Cycles: ? Denature 94 ℃ 30sec～ 1min ? Annealing Tm(2～ 10℃ ) 30sec～ 1min ? Extension 72 ℃ based on the length of amplicon ?Totally 3040 cycles ? Postextension:72 ℃ 7min PCR常見問題 ? 無擴(kuò)增產(chǎn)物 ? 非特異性擴(kuò)增 ? 拖尾 ? 假陽性 PCR常見問題之一 ? 無擴(kuò)增產(chǎn)物 1. 模板 :含有抑制物，含量低 2. Buffer對樣品不合適 3. 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解 4. 反應(yīng)條件： 退火溫度太高，延伸時間太短 原因 對 策 1. 純化模板或者使用試劑盒提取模板 DNA或加大模板的用量 2. 更換 Buffer或調(diào)整濃度 3. 重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物 4. 降低退火溫度、延長延伸時間 ?現(xiàn)象： 正對照有條帶 ， 而樣品則無 ； PCR常見問題之二 ? 非特異性擴(kuò)增 ? 現(xiàn)象： PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1